王學(xué)軍，胡二為，陶以成

（1.黑龍江省中醫(yī)研究院，哈爾濱 150006；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700）

丹槐銀屑濃縮丸是多年治療銀屑病的驗(yàn)方，臨床效果明顯[1]。方藥組成：紫草、白鮮皮、大青葉、黃連、槐花、生地、赤芍、丹參、雞血藤、白茅根、澤瀉等共11味中藥組成，其中以紫草為君，白鮮皮、大青葉、黃連、生槐花、赤芍、生地為臣，丹參、雞血藤、白茅根、澤瀉為佐。本方諸藥相互配伍，既能清解熱毒又無苦燥傷陰之弊，涼血分熱而無膚絡(luò)瘀阻之虞，血分熱毒得解，肌膚得養(yǎng)，鱗屑自退而癢止。諸藥相伍共奏清熱解毒、涼血活血、祛屑止癢之功。主治：血熱風(fēng)燥型白疕（進(jìn)展期銀屑?。?。銀屑病主要病理特征為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加快，角化不全，真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張，以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。為此，我們構(gòu)建了豚鼠耳部的銀屑病樣病理改變模型，觀察丹槐銀屑濃縮丸治療后的病理變化、VEGF及VEGFR水平，以期為丹槐銀屑濃縮丸治療銀屑病的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品及試劑 丹槐銀屑濃縮丸：由黑龍江省中醫(yī)研究院制藥廠提供（臨床研究批件號(hào)：黑L20080011，批號(hào)：090501)。復(fù)方青黛膠囊：陜西天寧制藥有限責(zé)任公司（功能主治：清熱解毒，化斑消瘀，祛風(fēng)止癢。用于進(jìn)行期銀屑病。國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010157， 批 號(hào) ：20090303）。 鹽 酸 普 萘 洛 爾(Propranolol hydrochloide)：Sigma公司，美國(guó)（貨號(hào)：p0884）。 氨甲喋呤（Methotrexate）：Pfizer（Perth）Pty Limited，澳大利亞（進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)：H20050413，批號(hào)：DW47E）。豚鼠VEGF和VEGFR酶聯(lián)免疫試劑盒：R&D 公司（Minneapolis，MN，USA）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 BIO-RAD680伯樂酶標(biāo)儀，美國(guó)。DV214C奧豪斯精密電子天平，美國(guó)。OLYMPUS（XSZ-H型）光學(xué)顯微鏡，日本。IKA勻漿器，德國(guó)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5周齡普通健康成年豚鼠，體重300～350g，雌雄不限，由哈爾濱市松北區(qū)華宇養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SCXX黑2007003。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 模型制備及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 參照文獻(xiàn)[2]。新進(jìn)的豚鼠70只飼養(yǎng)1周，雌雄分開，待其狀態(tài)良好，適應(yīng)飼養(yǎng)室環(huán)境后，第2周開始實(shí)驗(yàn)。把豚鼠雙耳剃毛，隨機(jī)分為7組，即：空白組、模型組、西藥對(duì)照組（甲氨喋呤組）、成藥對(duì)照組（復(fù)方青黛膠囊組）、以及丹槐銀屑濃縮丸低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。除空白組豚鼠外，其余六組都用5%普萘洛爾乳劑（黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室配制）均勻涂于雙側(cè)耳背，面積1cm2，厚度1mm。4次/d，共3周。

1.4.2 給藥方法 造模成功后，開始分組給藥。西藥對(duì)照組給予甲氨喋呤0.78mg/kg；成藥對(duì)照組給予復(fù)方青黛膠囊0.47g/kg；丹槐銀屑濃縮丸低、中（人的等效劑量）、高劑量組分別給1.16g/kg，2.32g/kg，4.64g/kg。各藥物均溶于生理鹽水，給藥體積為2mL/kg?？瞻捉M和模型組灌服生理鹽水2mL/kg。甲氨喋呤每隔2d一次，其他藥1次/d，共2周。每隔2d量體重1次，調(diào)整給藥量。

1.4.3 取材及材料處理 用藥2周后取材，5%烏拉坦麻醉數(shù)分鐘，頸動(dòng)脈采血后處死，隨即取雙側(cè)耳組織。耳組織分三份，其中一份液氮冷凍后-80℃冰箱保存（待組織勻漿用），其余兩份分別用10%甲醛溶液固定（組織切片）。

將10%甲醛溶液固定的標(biāo)本石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察病理改變。每組豚鼠雙側(cè)耳組織各做切片2張，用光鏡在10×20視野下觀察并攝圖（通過血球記數(shù)盤校正圖片的面積），分別隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)選中視野進(jìn)行Baker法[3]評(píng)分及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。Baker法積分評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)如下：角質(zhì)層中見有Munro小膿瘍計(jì)2.0分；過度角化計(jì)0.5分；角化不全計(jì)1.0分。表皮層中見有顆粒層變薄或消失計(jì)1.0分；棘層肥厚計(jì)1.0分；皮突延長(zhǎng)、基底層迂曲起伏，根據(jù)輕、中、重程度分別計(jì)0.5、1.0、1.5分；真皮層見有單一核及多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，根據(jù)輕、中、重程度分別計(jì)0.5、1.0、2.0分；乳突突出明顯計(jì)0.5分；真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張計(jì)0.5分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行。設(shè)P<0.01，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 丹槐銀屑濃縮丸對(duì)模型病理改變光鏡觀察結(jié)果 空白組光鏡下可見角質(zhì)層較薄，顆粒層細(xì)胞約為1～3層；棘層細(xì)胞約3～5層，為多角形；基底層為單層柱狀細(xì)胞，表皮突平坦；真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯，稀疏散在的淋巴細(xì)胞。模型組鏡下可見廣泛角化過度及灶性角化不全；顆粒層變薄或消失；棘層明顯肥厚，表皮突下延；毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，真皮淺層及乳頭部可見單一核及多形核細(xì)胞浸潤(rùn)。各組豚鼠耳部銀屑病樣病理改變Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)評(píng)分見表1。

方差分析結(jié)果表明：模型組和其余各組相比Baker評(píng)分和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)具有顯著差異（P<0.01），提示造模成功，各用藥組用藥有效。西藥對(duì)照組療效優(yōu)于成藥對(duì)照組（P<0.05），中、低劑量組療效接近西藥對(duì)照組（P>0.05），而高劑量組療效接近成藥對(duì)照組（P>0.05）。高、中、低各個(gè)劑量組之間，中劑量療效較好，低劑量組次之，高劑量組較差。中、低劑量組與西藥對(duì)照組鏡下均可見角化過度及角化不全現(xiàn)象明顯減輕，棘層變薄，表皮突明顯變平，未見Munro微膿瘍。見圖1。提示丹槐銀屑濃縮丸對(duì)豚鼠耳部銀屑病樣病理改變和炎癥現(xiàn)象具有抑制作用。但是，隨著劑量的升高，作用卻減弱，提示量-效關(guān)系不成正比，具體原因有待進(jìn)一步考察。

表1 各組豚鼠耳部銀屑病樣病理改變Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)評(píng)分（±s）

表1 各組豚鼠耳部銀屑病樣病理改變Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)評(píng)分（±s）

注：與模型組比較 *P<0.01；與西藥對(duì)照組比較▲P<0.01，茛P<0.05；與成藥對(duì)照組比較#P<0.05。

n 10 10 10 10 10 10 10 Baker評(píng)分1.25±0.88*5.80±1.06 2.95±0.90*3.90±0.84*3.95±0.84*▲3.10±0.97*3.20±0.85*組別空白組模型組西藥對(duì)照組成藥對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)評(píng)分4.05±1.43*25.30±6.43 9.80±2.90*14.90±4.18*16.40±5.33*茛▼10.60±5.02*#11.40±3.27*

圖1 各組豚鼠耳部皮膚常規(guī)病理像（HE染色×100）

2.2 丹槐銀屑濃縮丸對(duì)模型耳部組織勻漿VEGF、VEGFR含量的影響（雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法） 見表2。方差分析結(jié)果表明：丹槐銀屑濃縮丸各組對(duì)模型組織VEGF影響不大，但對(duì)VEGFR影響有顯著差異（P<0.01）。說明丹槐銀屑濃縮丸主要通過調(diào)節(jié)VEGFR來對(duì)模型微血管發(fā)生作用的。

表2 各組豚鼠耳部組織勻漿VEGF、VEGFR含量（±s）

表2 各組豚鼠耳部組織勻漿VEGF、VEGFR含量（±s）

注：與模型組比較#P<0.05，*P<0.01；與西藥對(duì)照組比較茛P<0.05；與成藥對(duì)照組比較▲P<0.01。

n 10 10 10 10 10 10 10 VEGF(ng/L)459.32±38.99#498.81±54.15 472.57±42.41 465.54±37.89 490.00±31.48 467.41±41.48 486.08±34.77組別空白組模型組西藥對(duì)照組成藥對(duì)照組高劑量組中劑量組低劑量組VEGFR(ng/mL)13.75±2.50*31.53±4.34 19.39±3.73*25.06±2.68*茛24.04±2.69*▼19.47±3.62*▲20.49±4.56*▲

3 討論

目前越來越多的研究表明，銀屑病的發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體密切相關(guān)。尋常性銀屑病患者皮損處的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA及其蛋白、受體和微血管密度表達(dá)明顯強(qiáng)于正常人對(duì)照組，患者血清中VEGF水平明顯高于正常人對(duì)照組，VEGF及其受體在銀屑病新生血管形成中起重要作用[4]。VEGFR在銀屑病發(fā)病過程中協(xié)同VEGF造成微循環(huán)的病理變化。文中結(jié)果顯示，模型組組織勻漿VEGF和VEGFR水平與空白組相比，差異較為顯著，各用藥組組織VEGF水平均有所降低，但差異不明顯。但是各用藥組VEGFR水平顯著降低，尤其是丹槐銀屑濃縮丸中劑量組效果較好，療效和西藥對(duì)照組相似。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，丹槐銀屑濃縮丸對(duì)皮損VEGF和VEGFR水平具有調(diào)節(jié)作用，可能是通過降低VEGFR水平來發(fā)揮作用。

［1］ 王學(xué)軍，賈麗梅.丹槐銀屑濃縮丸治療尋常型銀屑病264例臨床觀察[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2008，15（6）：474-475.

［2］ 黃畋，張淑芝，孫令.心得安涂藥造成豚鼠耳部銀屑病樣病理變化[J].中華皮膚科雜志，1991，24（2）：96-97.

［3］ Baker BS,Brent L,Valdimarsson H,etal.Is epidermal cell proliferation in psoriatic skin grafts on nudemice driven by T-cell derived cytokines?[J].Br JDermatol,1992，126：105-110.

［4］ 張錫寶，羅權(quán)，吳志華，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在銀屑病發(fā)病中的作用及意義[J].中華皮膚科雜志，2005，38（3）：140-142.