單海燕，白小涓，李效麗

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心血管科，沈陽(yáng) 110001）

血管內(nèi)皮功能受損是動(dòng)脈粥樣硬化早期事件的始動(dòng)環(huán)節(jié)，該損傷很可能是細(xì)胞凋亡增高所致［1，2］。細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究是凋亡研究最關(guān)鍵的領(lǐng)域之一［3］，因此本研究旨在觀察血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax mRNA及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellar signal-regulated protein kinase，ERK1/2）在不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)變化，揭示血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制，從而為延緩內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、防治動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶﹑HEPES、L-谷氨酰胺（Gibco公司，美國(guó)），人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）（ATCC，美國(guó)），AngⅡ、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）﹑Hochest33258（Sigma公司，美國(guó)），兔抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體非免疫血清、兔抗人ERK1/2單克隆抗體非免疫血清、生物素二抗、辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素（HRP-Streptaridin）試劑（Santa Cruz公司，美國(guó)），流式細(xì)胞儀 FACScan（BD 公司，美國(guó)），熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），Biophotometer分光光度儀（Eppendort公司，德國(guó)），GeneAmpPCR System9700擴(kuò)增儀（PE公司，美國(guó)），UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP公司，英國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC貼壁生長(zhǎng)，置于5%CO2、37℃、完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2~3 d換液1次。用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化﹑傳代。2%臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活性，活細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)98%以上者用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)比色（MTT）法測(cè)定細(xì)胞活性：將細(xì)胞接種于每孔含100μL培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中（1×104/孔），培養(yǎng)過(guò)夜；棄培養(yǎng)液，對(duì)照組（6孔）每孔加入100μL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組（6孔/組）加入含不同濃度（10-8﹑10-7﹑10-6﹑10-5﹑10-4mol/L）AngⅡ的100μL 培養(yǎng)液，培養(yǎng) 24 h；加入 MTT 10μL/孔，培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150μL/孔，振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm下測(cè)定各孔光吸收值，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組光吸收值的百分比代表存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合后，無(wú)血清同步6 h，加入AngⅡ（終濃度為10-6mol/L），持續(xù)刺激24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組（不含AngⅡ的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h）和AngⅡ組（含AngⅡ的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h）。收集細(xì)胞，常規(guī)涂片固定，Hoechst33258染色后封片。熒光顯微鏡觀察，照相。鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡百分率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡定量：收集1×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心，PBS洗2次，重懸細(xì)胞于200μL的1×結(jié)合緩沖液，加入10μLAnnexin V-FITC和5μL PI混勻，室溫避光15 min。加入300μL 1×結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞數(shù)，用Cell Quest軟件分析結(jié)果。

1.2.5 Bcl-2、Bax細(xì)胞免疫化學(xué)染色：將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中的潔凈蓋玻片上，分組干預(yù)后，PBS洗細(xì)胞，采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封固。在200倍的光鏡視野下觀察到胞質(zhì)或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中100個(gè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，每張切片中采集5個(gè)視野并求均值，得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率及Bcl-2/Bax值（BB值）［4］。

1.2.6 Western blot檢測(cè)ERK1/2蛋白水平：收集細(xì)胞，冷PBS洗2次，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，超聲破碎，冰上孵育提取物30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液至新試管中，再離心1次，取上清分裝，-20℃保存待用?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度。參照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行Western blot，蛋白電泳分離膠濃度為 12%（pH8.8），濃縮膠濃度 4%（pH6.8），抽提純化的蛋白（每個(gè)樣品20μL）行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過(guò)夜，加入兔抗人ERK1/2一抗（1︰100）室溫孵育3 h，TBST洗滌，加入二抗室溫孵育0.5 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色。AlphaImager圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，設(shè)對(duì)照組顯影帶灰度值為1，各不同時(shí)間組與其灰度值之比即為該組的相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率

MTT法檢測(cè)結(jié)果示，培養(yǎng)HUVEC 24 h后，10-7mol/L與10-8mol/L AngⅡ組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，10-6mol/L組存活細(xì)胞數(shù)降至對(duì)照組的（87.6±0.09）% （P<0.01），10-5mol/L 和 10-4mol/L組存活細(xì)胞數(shù)降至（45.6±0.08）%（P<0.01）。本實(shí)驗(yàn)選用10-6mol/L的AngⅡ建立了HUVEC的凋亡模型。

2.2 凋亡HUVECs的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化

Hochest33258熒光染色顯示，正常HUVEC細(xì)胞核邊界整齊，染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)（圖1A）；AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC則表現(xiàn)為細(xì)胞核呈濃染致密顆粒狀、塊狀熒光，出現(xiàn)不同程度的核固縮，呈現(xiàn)體積明顯縮小的深染核形態(tài)（圖1B）。

2.3 AngⅡ?qū)?xì)胞凋亡率的影響

圖1 正常組與AngⅡ誘導(dǎo)組HUVECs的形態(tài)學(xué)變化Hoechst33258染色×400Fig.1 HUVECs stained with Hoechst33258×400

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC平均凋亡率為（37.4±1.6）%，較正常對(duì)照組［（10.2±1.8）%］顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但2組間的細(xì)胞壞死率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 AngⅡ作用時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

細(xì)胞免疫化學(xué)染色法結(jié)果顯示，HUVEC在AngⅡ作用下，12 h時(shí)Bcl-2表達(dá)開(kāi)始減少，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，24 h時(shí)減少41.9%（P<0.01）；而Bax的表達(dá)則于12 h時(shí)開(kāi)始增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，24 h增加68.2% （P<0.01）；Bcl-2/Bax比值于12 h時(shí)開(kāi)始呈明顯下降趨勢(shì)（P均<0.01）。見(jiàn)表 1。

表1 各組HUVECs的Bcl-2、Bax的表達(dá)及Bcl-2/Bax的比較Tab.1 Expression of Bcl-2，Bax protein in immunocytochemistry staining and Bcl-2/Bax of HUVEC in each group

2.5 AngⅡ?qū)RK1/2表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，隨著AngⅡ作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVEC內(nèi)ERK蛋白質(zhì)磷酸化水平逐漸升高，12 h時(shí)達(dá)對(duì)照組的1.42倍（P<0.05），18 h時(shí)ERK蛋白磷酸化水平達(dá)高峰，為對(duì)照組的3.68倍（P<0.01），之后逐漸下降，但仍高于對(duì)照組，24 h時(shí)磷酸化水平為對(duì)照組的1.79倍（P<0.05）。2組內(nèi)皮細(xì)胞中總ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 各組HUVECs ERK1/2蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果Fig.2 Western blot analysis of ERK1/2 protein expressions of HUVECs in each group

3 討論

細(xì)胞外對(duì)外界刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)信號(hào)的快速傳遞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一［5，6］，其中 ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于 MAPK 家族［7，8］，它在炎性細(xì)胞應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用。大量研究證實(shí)，當(dāng)各種因素（如壓力負(fù)荷、腎上腺素、AngⅡ等）激活后，ERK1/2將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞至細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)生磷酸化，迅速穿過(guò)核膜作用于下游的信號(hào)分子［9~11］，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，從而參與細(xì)胞的基因表達(dá)、遷移、分化、凋亡和增殖調(diào)控作用［6，8，12］。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能顯著增加 HUVEC 內(nèi)ERK1/2磷酸化，提示AngⅡ可激活HUVEC的pERK1/2通路，但該途徑通過(guò)哪些蛋白發(fā)揮凋亡作用尚未知。

凋亡相關(guān)基因Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，Bax基因是Bcl-2家族的一員，其產(chǎn)物是一種與Bcl-2同源的相關(guān)蛋白，能夠拮抗后者的生物學(xué)活性［13］。Bax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡，并與Bcl-2一起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bax不僅能和Bcl-2形成異源二聚體抑制凋亡，而且其自身還能形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡［9，13，14］。研究表明，Bcl-2 及 Bax 二者間的比例對(duì)于細(xì)胞、組織的影響較絕對(duì)量更為重要，是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵因素。Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白和Bax、Bad等促進(jìn)凋亡的蛋白的相對(duì)比率決定了細(xì)胞多種凋亡刺激信號(hào)的最終敏感性和抵抗性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl-2表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax比值顯著降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Bcl-2降低與p-ERK1/2表達(dá)增加呈相關(guān)性，且Bcl-2/Bax比值與p-ERK1/2表達(dá)呈相反趨勢(shì)，提示p-ERK1/2與Bcl-2之間可能存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。由此我們推測(cè)在AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC的早、中期（6、12 h）顯著激活了ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且ERK1/2的表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，于12 h時(shí)明顯上升，18 h達(dá)高峰，24 h下降至穩(wěn)定，表明隨著AngⅡ持續(xù)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)已發(fā)生表型改變HUVEC中ERK信號(hào)通路的激活作用已開(kāi)始增強(qiáng)，同時(shí)研究進(jìn)一步顯示，磷酸化ERK1/2表達(dá)呈持續(xù)增加時(shí)，Bcl-2及Bcl-2/Bax比值呈顯著下降趨勢(shì)，表明ERK1/2信號(hào)途徑可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax參與HUVEC凋亡。雖然發(fā)現(xiàn)ERK1/2可作為上游信號(hào)參與調(diào)節(jié)Bcl-2，但是p-ERK如何調(diào)節(jié)Bcl-2目前尚不清楚，其作用環(huán)節(jié)仍有待進(jìn)一步研究。

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