范斌，杜強(qiáng)，谷劍秋，張錦

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004；2.附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110004；3.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng)110001）

單核細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的間隙移入內(nèi)膜下并分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬體內(nèi)過(guò)剩的脂質(zhì)后變成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞聚集并形成斑塊是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)［1，2］。研究表明，perilipin2與泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)，在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型ApoE-/-鼠的實(shí)驗(yàn)中，敲除perilipin2基因能顯著抑制泡沫細(xì)胞及斑塊的形成［3］，提示perilipin2是治療動(dòng)脈粥樣硬化的理想分子目標(biāo)，下調(diào)perilipin2的表達(dá)有助于減少泡沫細(xì)胞的形成。我們通過(guò)對(duì)一系列具有抗炎、抗氧化作用的天然化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)法國(guó)海岸松樹(shù)皮提取物—碧蘿芷（Pycnogenol，PYC）能夠抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2的表達(dá)，并進(jìn)一步探討了其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

油酸（oleic acid，OA）（Wako Pure Chemical Industries，日本），perilipin2單克隆抗體（PROGEN Biotechnik，德國(guó)），GAPDH單克隆抗體、過(guò)氧化物酶耦聯(lián)羊抗豚鼠IgG及羊抗鼠抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)），Western blot試劑盒（GE Healthcare，英國(guó)），轉(zhuǎn)染試劑、Lipofectamine PLUS reagent（Invtrogen，美國(guó)），熒光素發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Promega，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄 ReverTra Ace-a kit試劑盒（Toyobo，Osaka 日本），Real-time PCR SYBR Green試劑盒（Bio-Rad，美國(guó)），空白pGL3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，包含perilipin2啟動(dòng)子-2 090 bp區(qū)域的pGL3質(zhì)粒，對(duì)照pRL-TK質(zhì)粒及PYC由日本九州大學(xué)附屬病院第三內(nèi)科生山祥一郎教授慷慨提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞株（RIKEN，日本）1×106個(gè)接種于10 mLα-MEM培養(yǎng)基中（100 mL/L胎牛血清，1×105U/L青霉素），置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。1~2 d傳代1次。50μg/mL碧羅芷或DMSO預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1 h后，200 μmol/L油酸刺激細(xì)胞24h，行Real-timePCR及Westernblot檢測(cè)perilipin2mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

1.2.2 Real-time PCR：按 Isogen說(shuō)明書(shū)提取總RNA。取0.5μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄ReverTra Ace-a kit說(shuō)明書(shū)操作合成單鏈cDNA，鼠perilipin2上游引物序列：5′-CTGTCTACCAAGCTCTGCTC-3′，下游引物序列：5′-CGATGCTTCCTTCCACTCC-3′。 GAPDH上游引物序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列：5′-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3′。按SYBER Green Real-time PCR熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，總反應(yīng)體積25μL（12.5μLSYBERGreen supermix 5μL，1︰20稀釋的cDNA，各引物的終濃度為320 nmol/L），以GAPDH為內(nèi)參照物，perilipin2量以對(duì)GAPDH的相對(duì)誘導(dǎo)倍數(shù)表示。

1.2.3 Western blot：用4℃預(yù)冷裂解液（含pH 7.5 50 mmol/L Tris-HCl，0.5 g/L Nonidet 40、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、150 mmol/L NaC1、100 mL/L甘油、50 mmol/L氟化鈉、10 mmol/L焦磷酸鈉、1 mmol/L礬酸鈉、80μmol/Lβ甘油磷酸、1 mmol/L PMSF、10 mg/Laprotinin、100 mg/L soybean trypsin inhibitor和10 mg/L leupeptin）裂解細(xì)胞。取25μg蛋白，95℃變性5 min后，經(jīng)120 g/LSDS2PAGE行垂直電泳（100 V×90 min），室溫100 V ×100 min轉(zhuǎn)膜，50 g/L牛奶室溫封閉1 h。結(jié)合一抗（豚鼠抗鼠ADRPmAb，1∶200 稀釋?zhuān)?，室?1 h，結(jié)合二抗（羊抗豚鼠，1∶20 000 稀釋?zhuān)?，室?1 h。感光、洗片，蛋白條帶掃描后行光密度分析。

1.2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性分析：用Lipofectamine PLUSreagent轉(zhuǎn)染試劑，按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將 RAW264.7細(xì)胞（2×105/孔）接種于 12孔板，培養(yǎng)24 h后，改為去除胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染混合液 50μL（Lipofectamine 2μL，PLUSreagent 5 μL，1μg熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，0.4μg pRL-TK 質(zhì)粒，用去除胎牛血清培養(yǎng)液調(diào)整至50μL），37℃轉(zhuǎn)染4 h。1×PBS洗滌，改為包含胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基，PYC預(yù)處理1 h后，用相應(yīng)濃度油酸培養(yǎng)24 h。收集并裂解細(xì)胞，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，按說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。根據(jù)對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK Renilla活性標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SSPS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 油酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖1 油酸以濃度依賴(lài)方式上調(diào)RAW264.7細(xì)胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.1 Oleic acid stimulated perilinpin2 expression in a dosedependent manner in RAW 264.7 cells

長(zhǎng)鏈游離脂肪酸可誘導(dǎo)perilipin2表達(dá)，因此我們首先檢測(cè)了長(zhǎng)鏈游離脂肪酸的代表—油酸對(duì)鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞perilipn2表達(dá)的影響。結(jié)果提示，油酸以劑量依賴(lài)的方式顯著誘導(dǎo)了perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)（圖1）。由于200 μmol/L油酸對(duì)perilipin2 mRNA和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用最顯著且未見(jiàn)任何毒性作用，因此我們選用濃度200μmol/L進(jìn)行下一步研究。結(jié)果顯示，200 μmol/L油酸以時(shí)間依賴(lài)的方式顯著誘導(dǎo)了perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)（圖2），刺激24 h時(shí)誘導(dǎo)效果最顯著。

圖2 油酸以時(shí)間依賴(lài)方式上調(diào)RAW264.7細(xì)胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.2 Oleic acid stimulated perilinpin2 expression in a timedependent manner in RAW 264.7 cells

2.2 PYC抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2表達(dá)

我們的前期研究證明，肝細(xì)胞中PYC可下調(diào)perilipin2的表達(dá)，從而抑制脂質(zhì)在肝細(xì)胞的聚集［4］。因此，本研究中我們檢測(cè)了PYC對(duì)巨噬細(xì)胞中perilipin2表達(dá)的影響。結(jié)果表明，PYC以劑量依賴(lài)方式顯著抑制了油酸誘導(dǎo)的perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)。50μg/mLPYC幾乎完全抑制了油酸誘導(dǎo)的perilipin2表達(dá)（圖3）。

2.3 PYC抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2啟動(dòng)子的活性

圖3 PYC抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2表達(dá)Fig.3 PYC suppressed OA-induced perilipin2 expression

我們?cè)谇捌谘芯恐袠?gòu)建了包含perilipn2基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-2 090 bp的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，通過(guò)熒光素酶活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油酸顯著誘導(dǎo)了perilipin2啟動(dòng)子的活性，使其升高了4.5倍（圖4）。下一步我們檢測(cè)了PYC是否可以抑制油酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)染包含perilipin2啟動(dòng)子區(qū)域-2 090 bp pGL3熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒至RAW264.7細(xì)胞，50μg/mL PYC預(yù)處理1 h后，用油酸連續(xù)刺激24 h。熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，PYC顯著抑制了油酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性（圖4）。提示PYC通過(guò)抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2啟動(dòng)子的活性而抑制了perilipin2的表達(dá)。

圖4 PYC抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2啟動(dòng)子活性Fig.4 PYCsuppressed OA-induced perilipin2 promoter activity

3 討論

研究表明，PAT（perilipin，adipophilin，Tip47）家族蛋白鑲嵌在細(xì)胞內(nèi)脂肪滴表面，調(diào)控脂肪滴和脂質(zhì)的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)、聚集和脂肪分解。PAT家族蛋白包括 ：perilipin，adipose differentiation-related protein（ADRP），tail-interacting protein of 47 kDa（TIP47），現(xiàn)重新命名為 perilipin1，perilipin2 和 perilipin3［5，6］。其中perilipin2在巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞及動(dòng)脈硬化斑塊中選擇性高表達(dá)，提示perilipin2表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化形成密切相關(guān)［7，8］。長(zhǎng)鏈游離脂肪酸、oxLDL、VLDL、PPAR配體及 TRL4，9信號(hào)通路均可上調(diào)perilipin2 的表達(dá)［6，9，10］。由于長(zhǎng)鏈脂肪酸是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）的配體，并通過(guò)激活PPAR來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，在人和鼠的perilipin2啟動(dòng)子上游均存在PPAR反應(yīng)原件（PPRE），因此，我們推測(cè)長(zhǎng)鏈脂肪酸是通過(guò)激活PPAR誘導(dǎo)perilipin2表達(dá)的［4，11，12］。本研究選用油酸作為長(zhǎng)鏈脂肪酸的代表誘導(dǎo)perilipin2的表達(dá)，結(jié)果表明，在鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中，油酸以劑量和濃度依賴(lài)方式顯著誘導(dǎo)了perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)，濃度為200μmol/L時(shí)誘導(dǎo)作用最顯著。接下來(lái)我們構(gòu)建了包含PPRE的perilipin2啟動(dòng)子區(qū)域-2 090 bp的pGL3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，油酸顯著誘導(dǎo)了perilipin2啟動(dòng)子的活性，提示油酸通過(guò)激活PPAR誘導(dǎo)了perilipin2的表達(dá)。

研究顯示，perilipin2過(guò)表達(dá)增加了人單核細(xì)胞系THP-1源性巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積，在誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的過(guò)程中或用氧化修飾的低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞時(shí)，perilipin2的表達(dá)均上調(diào)［7］。另外，perilipin2在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和斑塊內(nèi)的泡沫細(xì)胞中也高度表達(dá)［8］。最近關(guān)于perilipin2和ApoE雙基因敲除鼠的研究表明，perilipin2基因的敲除抑制了泡沫細(xì)胞形成及動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)展［3］。這些研究結(jié)果提示，perillipin2在巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)與泡沫細(xì)胞形成和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制perilipin2的表達(dá)有助于延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

PYC是法國(guó)海岸松樹(shù)皮提取物，目前作為健康食品和化妝品成分已在包括中國(guó)在內(nèi)的40多個(gè)國(guó)家上市。PYC由低聚原花青素、果酸及生物類(lèi)黃酮等40多種小分子水溶性生物活性成分組成，是最強(qiáng)的天然抗氧化劑。研究表明，PYC具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，降低2型糖尿病患者血糖、血脂，改善微循環(huán)的作用［13~16］。本研究結(jié)果首次證明，PYC以濃度依賴(lài)方式顯著抑制了油酸誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達(dá)，并可能因此抑制泡沫細(xì)胞的形成。為進(jìn)一步明確其機(jī)制，我們檢測(cè)了PYC對(duì)perilipin2啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果表明，PYC以濃度依賴(lài)方式抑制油酸誘導(dǎo)的perilipin2啟動(dòng)子活性，提示PYC是通過(guò)抑制PPAR活性而抑制啟動(dòng)子活性的。鑒于PPAR在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過(guò)程中的復(fù)合作用，我們有理由相信抑制PPAR活性有可能是PYC調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常的基本分子機(jī)制。

總之，本研究證明了在巨噬細(xì)胞中PYC抑制了油酸誘導(dǎo)的perilipin2表達(dá)，并進(jìn)一步揭示PYC是通過(guò)抑制perilipin2啟動(dòng)子活性而直接抑制perilipin2表達(dá)的，為將來(lái)PYC應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了理論支持。

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