茹筱晨，梁科勇，雷文華，譚伊諾，夏 強(qiáng)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，杭州 310058)

RU Xiao-chen，LIANG Ke-yong，LEI Wen-hua，TAN Yi-nuo，XIA Qiang

未有bicyclol心血管作用的報道。本研究旨在觀察bicyclol對離體大鼠胸主動脈張力的直接作用，著重探討bicyclol對氧化應(yīng)激所致血管功能損傷的影響及其可能機(jī)制。

血管內(nèi)皮功能紊亂在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激狀態(tài)是造成血管內(nèi)皮損傷的重要因素。血管壁內(nèi)可產(chǎn)生多種活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧陰離子()和羥自由基(HO?)、過氧化氫(H2O2)等。實驗動物模型及臨床研究表明，在心血管疾病發(fā)生過程中伴隨著ROS的大量釋放，導(dǎo)致動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能受損[2，3]。雙環(huán)醇(bicyclol)是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的新型抗肝炎藥。研究表明，bicyclol能對抗多種實驗性肝損傷和腎缺血/復(fù)灌損傷，其機(jī)制可能與對抗氧化應(yīng)激有關(guān)[4，5]。目前尚

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

bicyclol由北京協(xié)和藥廠提供。苯腎上腺素(phenylephrine，PE)，乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)，吲哚美辛(indomethacin，Indo)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，焦酚(pyrogallol)均購自Sigma公司。吲哚美辛溶于含0.7%(wt/vol)碳酸鈉的溶液中;L-NAME溶于二甲基亞砜(dimethyl sul-foxide，DMSO)中，DMSO終濃度不超過0.1%。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118.00，KCl 4.70，CaC121.25 ，KH2PO41.20，MgSO41.20，NaHCO325.00，glucose10.00。

1.2 胸主動脈環(huán)的制備

本實驗采用雄性SD大鼠，體重240～280g，由浙江大學(xué)實驗動物中心提供。取大鼠胸主動脈，置于4℃的Krebs-Henseleit(K-H)液中，小心去除血管周圍脂肪及結(jié)締組織，制成長約3 mm的血管環(huán)。制備去內(nèi)皮血管環(huán)時，使用棉簽?zāi)Σ裂墉h(huán)內(nèi)表面以去內(nèi)皮。血管環(huán)懸掛于加有37℃K-H液的浴槽中，持續(xù)通入95%O2+5%CO2的混合氣體，連于張力傳感器，MedLab微機(jī)生物信號采集處理系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力。調(diào)節(jié)至2 g預(yù)張力，每隔15 min換液1次，平衡 1 h后，加入KCl(6×10-2mol/L)收縮血管環(huán)，重復(fù)三次，以激發(fā)血管環(huán)活性。以PE(10-6mol/L)激發(fā)血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，加入ACh(10-5mol/L)檢驗血管內(nèi)皮是否完整，若加ACh后血管舒張程度大于60%，可認(rèn)為內(nèi)皮基本完整;若小于60%，則認(rèn)為內(nèi)皮被破壞。

1.3 bicyclol對PE預(yù)收縮的主動脈環(huán)張力的影響

取內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)，向浴槽加入PE(10-6mol/L)，待血管環(huán)收縮達(dá)到平臺后，采用累積加藥方法，加入bicyclol(10-8～10-5mol/L)。以加入bicyclol后的血管收縮幅度與PE誘發(fā)的最大收縮幅度之間的比值反映血管張力。在部分實驗中，取內(nèi)皮完整的血管環(huán)，加入NO合酶抑制劑L-NAME(10-4mol/L)和/或環(huán)氧化酶抑制劑Indo(10-5mol/L)，預(yù)孵育30min后，按上法測定bicyclol對PE預(yù)收縮血管張力的影響。

1.4 超氧陰離子誘導(dǎo)的胸主動脈舒張功能損傷

取去內(nèi)皮血管環(huán)，加入焦酚(500μmol/L)，孵育15 min后洗脫，加入PE(10-6mol/L)使血管收縮達(dá)到平臺后累積加入NO供體SNP(10-9～10-5mol/L)，檢測主動脈環(huán)對SNP的舒張反應(yīng)。以加入SNP后的血管張力幅度與PE誘發(fā)的最大收縮幅度之間的比值反映血管的舒張性能。

1.5 bicyclol對超氧陰離子所致主動脈舒張功能損傷的影響

取內(nèi)皮完整血管環(huán)，以最大效應(yīng)濃度的bicyclol(10-5mol/L)孵育30min后給予500μmol/L 焦酚，共孵育15 min，洗脫，加入PE使其收縮達(dá)到平臺后累積加入ACh(10-9～10-5mol/L)，檢測血管對ACh的舒張反應(yīng)。在部分實驗中，與bicyclol同時加入Indo(10-5mol/L)或L-NAME(10-4mol/L)，以觀察NO和前列環(huán)素介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 bicyclol對主動脈環(huán)的舒張作用

bicyclol(10-8～10-5mol/L)使由PE(10-6mol/L)預(yù)收縮的內(nèi)皮完整主動脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張。NO合酶抑制劑L-NAME(10-4mol/L)或環(huán)氧化酶抑制劑Indo(10-5mol/L)單獨預(yù)處理部分阻斷了bicyclol的舒血管作用，而兩者合用則使該作用完全消失(圖1A)。bicyclol對去內(nèi)皮主動脈環(huán)無明顯的舒張效應(yīng)(圖1B見下頁)。

2.2 超氧陰離子對主動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的影響

ACh(10-9～10-5mol/L)引起由 PE(10-6mol/L)預(yù)收縮的內(nèi)皮完整主動脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張。分別將50，100，500和1000μmol/L的焦酚加入浴槽中孵育15 min，可不同程度地抑制血管對ACh的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。與對照組相比，500μmol/L焦酚可以引起ACh誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)顯著減弱(表1，圖2見下頁)。因此，選擇500μmol/L焦酚作為外源性氧化應(yīng)激源，復(fù)制過氧化損傷模型。

2.3 超氧陰離子對主動脈內(nèi)皮非依賴性舒張反應(yīng)的影響

在PE(10-6mol/L)預(yù)收縮的去內(nèi)皮主動脈環(huán)上，外源性NO供體SNP(10-9～10-5mol/L)可引起濃度依賴性舒張。與對照組相比，焦酚(500μmol/L)孵育15 min對SNP誘導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性血管舒張反應(yīng)無顯著影響(圖3見下頁)。

Tab.1 Effect of pyrogallol-exposure on acetylcholine-induced relaxation in endothelium-intact rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine(10-6mol/L)，pD2 and Emaxvalues were calculated(，n=6)

Tab.1 Effect of pyrogallol-exposure on acetylcholine-induced relaxation in endothelium-intact rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine(10-6mol/L)，pD2 and Emaxvalues were calculated(，n=6)

Emax:Maximum response;pD2:Negative logarithm of the concentration of the drug required to produce 50%of maximum response*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Index Control Pyrogallol(μmol/L)50 100 500 1000pD2 7.00±0.04 7.04±0.05 7.01±0.05 6.62±0.17* 6.48±0.19**Emax(%) 98.32±3.37 86.77±6.64* 78.28±5.72** 40.11±9.58** 35.85±8.17**

Fig.1 Vasodilating effect of bicyclol on rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine

2.4 bicyclol對氧化應(yīng)激所致血管舒張功能損傷的對抗作用

與對照組相比，焦酚(500μmol/L)預(yù)孵育15 min可明顯抑制ACh(10-9～10-5mol/L)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。bicyclol(10-5mol/L)預(yù)孵育45 min可使焦酚損傷后的主動脈環(huán)舒張反應(yīng)有顯著改善，血管舒張幅度高于單獨焦酚損傷組，但仍低于對照組(圖4A)。

Indo(10-5mol/L)和L-NAME(10-4mol/L)預(yù)孵育主動脈環(huán)45 min后，ACh(10-9～10-5mol/L)可引起血管的濃度依賴性舒張。焦酚(500μmol/L)預(yù)孵育15 min顯著降低了血管對ACh的反應(yīng)性。與Indo同時加入bicyclol(10-5mol/L)可抑制焦酚引起的血管舒張反應(yīng)降低，但對于L-NAME預(yù)處理的主動脈環(huán)，bicyclol(10-5mol/L)對焦酚誘導(dǎo)的血管舒張功能損傷未見顯著影響(圖4B，C)。

Fig.2 Effect of different concentrationsof pyrogallol on endothelium-dependent relaxation in rat thoracic aortic rings.After exposure to pyrogallol(Pyr，50，100，500，1000μmol/L)for 15 min，endothelium-intact preparations were contracted with phenylephrine(10-6mol/L)and acetylcholine(ACh，10-9～10-5mol/L)was added in a cumulative manner.The control group was treated with the solvents of pyrogallol before phenylephrine and ACh was applied(，n=6)

Fig.3 Effect of pyrogallol-exposure on endothelium-independent relaxation in rat thoracic aortic rings.After exposure to pyrogallol(Pyr，500μmol/L)for 15min，the endothelium-denuded preparationswere contracted with phenylephrine(10-6mol/L)and sodium nitroprusside(SNP，10-9～ 10-5mol/L)was added in a cumulative manner.The control group was treated with the solvents of pyrogallol before phenylephrine and SNP was applied(，n=6)

Fig.4 Effect of bicyclol on superoxide anion-induced inhibition of endothelium-dependent relaxation in rat thoracic aortic rings(，n=6)

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，bicyclol對由PE預(yù)收縮的大鼠內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)產(chǎn)生舒張作用，該作用在去除血管內(nèi)皮后消失，提示bicyclol的舒血管效應(yīng)是內(nèi)皮依賴性的。

血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，通過這些物質(zhì)之間的相互平衡，調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒縮活動。內(nèi)皮分泌的血管舒張因子主要有三種，即一氧化氮(nitric oxide，NO)，前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)和內(nèi)皮源性超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF)，三者的分布因血管類型的不同而異[7]。在小血管中，EDHF含量較高，通過開放鉀通道引起平滑肌的舒張;而在主動脈(大血管)中，內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)主要由NO和PGI2介導(dǎo)，它們分別通過cGMP途徑和cAMP途徑引起血管平滑肌的舒張。本實驗中，運用L-NAME和吲哚美辛分別抑制NO或PGI2的生成可阻斷bicyclol引起的主動脈環(huán)舒張，表明bicyclol的舒血管作用由NO途徑和PGI2途徑介導(dǎo)。

血管內(nèi)皮功能失調(diào)主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙，以NO等舒血管物質(zhì)活性降低為特征。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和(或)清除能力降低，導(dǎo)致ROS蓄積而造成血管內(nèi)皮損傷。焦酚被廣泛用于實驗性氧化應(yīng)激損傷模型的復(fù)制，它在溶液中迅速自氧化產(chǎn)生，而在ROS損傷中起著重要作用[6]。本實驗中，我們觀察了不同濃度的焦酚對ACh誘導(dǎo)的大鼠胸主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的影響，從中選擇了500μmol/L焦酚作為外源性氧化應(yīng)激源。該濃度可引起血管內(nèi)皮依賴性舒張效應(yīng)顯著減弱，說明已造成血管內(nèi)皮的過氧化損傷。而在去內(nèi)皮的主動脈環(huán)上，焦酚不影響外源性NO供體SNP引起的內(nèi)皮非依賴性舒張，說明500μmol/L這一濃度的焦酚對血管平滑肌的舒張功能無明顯損傷。

Bicyclol(4，4'-二甲氧基-5，6，5'，6'-雙(亞甲二氧基)-2-羥甲基-2-甲氧羰基聯(lián)苯)是人工合成的一類抗病毒性肝炎新藥，對乙型和丙型肝炎都有較好的對抗作用[8]。實驗研究表明，bicyclol可對抗乙醇、四氯甲烷、乙酰氨基酚等多種化學(xué)毒性物質(zhì)所致的實驗性肝損傷，其機(jī)制可能與清除ROS、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。近來有文獻(xiàn)報道，bicyclol可減輕肝和腎的缺血/復(fù)灌損傷，抑制損傷過程中的脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定線粒體膜[4，5]。由此，我們推測，bicyclol對血管的氧化應(yīng)激損傷可能也存在保護(hù)作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，bicyclol預(yù)處理可使焦酚損傷后的主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)有明顯改善。NO和PGI2均參與介導(dǎo)ACh誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)[9，10]。用吲哚美辛阻斷PGI2生成后，ACh仍可誘導(dǎo)主動脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張，焦酚導(dǎo)致的暴露則顯著降低了血管對ACh的反應(yīng)性，提示NO介導(dǎo)的舒血管作用被所抑制;同樣，用L-NAME阻斷NO后，焦酚也導(dǎo)致ACh誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)減弱，提示PGI2也被所抑制。上述結(jié)果表明，焦酚來源的可能通過抑制血管內(nèi)皮NO和PGI2作用的發(fā)揮，從而導(dǎo)致了血管舒張功能的障礙。在NO介導(dǎo)的舒血管效應(yīng)中，bicyclol預(yù)處理可抑制引起的血管舒張反應(yīng)降低;而在PGI2介導(dǎo)的舒血管效應(yīng)中，bicyclol無類似抗氧化損傷作用。因此，bicyclol對過氧化損傷后主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的改善作用可能由NO途徑介導(dǎo)。

綜上所述，對于大鼠胸主動脈，bicyclol具有內(nèi)皮依賴性舒血管作用，該作用由NO和PGI2共同介導(dǎo)。bicyclol預(yù)處理減輕了誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙，其作用機(jī)制可能是對抗引起的NO舒血管途徑抑制，而PGI2途徑未參與bicyclol的抗氧化作用。此外，bicyclol究竟通過何種機(jī)制作用于NO途徑，以及為什么PGI2途徑介導(dǎo)了bicyclol的舒血管效應(yīng)，卻未參與其抗血管內(nèi)皮氧化損傷作用，有待進(jìn)一步深入探討。

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