方 銘，吳心池，黃文龍，施廣德

(江陰市人民醫(yī)院，江蘇江陰 214400)

金屬蛋白酶(MMPs)是一組具有類似結(jié)構(gòu)和共同生物化學(xué)性質(zhì)的金屬依賴性蛋白水解酶，能降解除多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡以及細(xì)胞間的相互作用等許多重要過(guò)程[1]。趨化因子 Fractalkine(Fkn)是 CX3C亞族成員，在腎系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球和腎小管間質(zhì)組織等都有表達(dá)，且與炎性組織的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)，不僅具有趨化作用，還具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、介導(dǎo)免疫損傷、細(xì)胞毒等功能[2]。 2009年 8月 ～2010年 10月 ，我們以體外培養(yǎng)的人腎系膜細(xì)胞(HRMC)為模型，觀察MMP-2對(duì)不同狀態(tài)下 HRMC干預(yù)后上清中趨化因子 Fkn釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HRMC株(為 T-SV40及 H-ras原癌基因轉(zhuǎn)染)、人重組 MMP-2(PeproTech公司)、人 Fkn 96孔 ELISA試劑盒(R＆D公司產(chǎn)品)、人 Fkn ELISA試劑盒(武漢博士德公司產(chǎn)品)、RT-PCR試劑盒(Fermentas)、國(guó)產(chǎn)分析純、CO2恒溫培養(yǎng)箱(NAP2CO)、洗板機(jī) (Model 1575，BIO-RAD產(chǎn)品 )、酶標(biāo)儀(Model 550 BIO-RAD產(chǎn)品)。

1.2 方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按 1∶3移入6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng) 80%～90%融合時(shí)，換用無(wú)血清的 DMEM同步化饑餓 24 h，按下列分組進(jìn)行干預(yù)。①空白對(duì)照組:不同濃度的激活 MMP-2(0.625、1.25、2.5、5.0 ng/ml)對(duì) HRMC作用 4 h，同時(shí)不加干預(yù)劑作為對(duì)照組，然后收集上清。②BSA組:BSA(濃度為 200 mg/L)干預(yù) HRMC 24 h后再加用以上 4種不同濃度的激活 MMP-2對(duì) HRMC作用4 h，同時(shí)不加干預(yù)劑作為對(duì)照組，然后收集上清。③AGE-BSA組:AGE-BSA(濃度為 200 mg/L)干預(yù)HRMC 24 h后再加用以上 4種不同濃度的激活MMP-2對(duì) HRMC作用 4 h，同時(shí)不加干預(yù)劑作為對(duì)照組，然后收集上清。ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清 Fractalkine蛋白質(zhì)水平，按照人 Fractalkine 96孔 ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，結(jié)果取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS13.0軟件包，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用S-N-K檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

綜合比較，重組人 MMP-2干預(yù)后 3組上清中的Fkn的濃度均明顯下降(P均 ＜0.01)，AGE-BSA組Fkn表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。空白對(duì)照組在基礎(chǔ)狀態(tài)下，HRMC表達(dá) Fkn(236.42±16.25)pg/ml;重組人 MMP-2干預(yù)后，上清中 Fkn濃度表達(dá)量隨著 MMP-2濃度的增加而明顯下降(P均＜0.05)。BSA組在 BSA 200 mg/L狀態(tài)下，HRMC表達(dá) Fkn(364.33±9.15)pg/ml;重組人 MMP-2干預(yù)后，上清中 Fkn濃度表達(dá)量隨著 MMP-2濃度的增加而明顯下降(P均 ＜0.05)。AGE-BSA組在 AGEBSA 200 mg/L狀態(tài)下，HRMC表達(dá) Fkn(1 055.46±26.24)pg/ml;重組人 MMP-2干預(yù)后，上清中 Fkn表達(dá)量隨著 MMP-2濃度的增加而明顯下降(P均 ＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度 MMP-2對(duì) HRMC培養(yǎng)上清 Fkn濃度的影響

3 討論

糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，糖基化終產(chǎn)物(AGEs)堆積是 DN的主要發(fā)病機(jī)制之一。AGEs促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖和 ECM增多。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和 ECM代謝失衡是 DN發(fā)生發(fā)展中 2個(gè)最重要的病理生理環(huán)節(jié)，趨化因子吸引單核巨噬細(xì)胞進(jìn)入腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)是始動(dòng) DN的早期事件，而 ECM積聚則構(gòu)成 DN主要病理改變——基底膜增厚、系膜擴(kuò)張最終發(fā)生腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的分子基礎(chǔ)[1，2]。

目前，對(duì)于 DN中 MMP-2與 Fkn的相互作用還不清楚。因此，我們假設(shè)在 DN早期，持續(xù)高血糖、AGEs等作用下，導(dǎo)致 ECM生成和降解動(dòng)態(tài)平衡的重要體系遭到破壞，可以導(dǎo)致腎系膜細(xì)胞等腎小球組織產(chǎn)生和分泌 Fkn增加。一方面，F(xiàn)kn兼具趨化與黏附特性，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在腎小球系膜區(qū)浸潤(rùn)與聚集，而它們通過(guò)自分泌或者旁分泌的作用始動(dòng)并加速 DN的發(fā)生發(fā)展;而另一方面，F(xiàn)kn作用于單核巨噬細(xì)胞，使 MMP-2和 MMP-9的產(chǎn)生及分泌減少，從而使各型膠原、纖維連接蛋白等 ECM成分降解減少，ECM異常積聚，ECM生成和降解動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，從而促進(jìn) DN的發(fā)生發(fā)展[3，4]。

本研究結(jié)果顯示，AGE-BSA增加 HRMC的合成和釋放 Fkn，其可能的機(jī)制為:AGEs刺激糖尿病患者腎系膜細(xì)胞產(chǎn)生和分泌 Fkn，F(xiàn)kn趨化、黏附單核巨噬細(xì)胞到達(dá)腎系膜區(qū)并促使它們沉積于系膜細(xì)胞參與 DN發(fā)生的早期事件;同時(shí)，AGEs通過(guò)對(duì)浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞旁分泌作用和(或)自分泌作用抑制腎系膜細(xì)胞和單核細(xì)胞 MMP-2表達(dá)及其活性，不僅使 ECM積聚增加，而且影響了 MMP-2對(duì) Fkn的效應(yīng)，減少了 Fkn的裂解，從而導(dǎo)致Fkn發(fā)揮細(xì)胞黏附、細(xì)胞毒性、遷移作用，形成惡性循環(huán)。應(yīng)用MMP-2干預(yù) HRMC后上清中的 Fkn減少，其可能的原因?yàn)?①HRMC合成和分泌 Fkn減少;②Fkn被MMP-2裂解成小肽，ELISA方法無(wú)法測(cè)出;③Fkn和單核細(xì)胞膜上受體結(jié)合而不能被測(cè)出[5]。

本研究模型為體外培養(yǎng) HRMC，而體內(nèi)環(huán)境更為復(fù)雜，受干擾的因素更多，況且糖尿病常合并有其他疾病。DN的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素參與的病理過(guò)程，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，且細(xì)胞株經(jīng)反復(fù)傳代后，其形態(tài)和功能都可能發(fā)生一定程度的改變。故該結(jié)論尚需反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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