王紅鮮，陶霖玉，齊 柯，向 紅，張好云，馮 鐸，孔 恒，林秋生，陳天文

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院，廣東深圳 518052)

研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7不僅能提高許多腫瘤細(xì)胞的生存和生長活力，還能增強其黏附和遷移能力。應(yīng)用 CXCR7拮抗劑還可抑制實驗動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[1]，但 CXCR7對人結(jié)腸癌細(xì)胞生物活性的影響未見報道。本研究以人結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞系為研究對象，運用 CXCR7-shRNA慢病毒表達(dá)載體沉默 CXCR7基因的表達(dá)，觀察其對 HT-29細(xì)胞的生長和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供，采用 RPMI 1640和 DMEM完全培養(yǎng)基(均含 10%小牛血清，100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，置 5%CO2的 37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。CXCR7-shRNA慢病毒表達(dá)載體根據(jù)人 CXCR7序列(GeneBank，NM_020311)設(shè)計 siRNA靶點序列，合成 shRNA引物序列[2];陰性無關(guān)對照序列的 shRNA重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由 Trono Lab提供。Rabbit anti-CXCR7多克隆抗體、Rabbit anti-GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記Goat anti-Rabbit IgG由 Abcam公司提供，RIPA蛋白裂解液(強)、PMSF蛋白酶抑制劑由碧云天生物技術(shù)有限公司提供，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Upstate公司。

1.2 方法 ①實驗分組:將人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29分成 3組:實驗組:轉(zhuǎn)染慢病毒 CXCR7-shRNA表達(dá)載體;陰性對照組:轉(zhuǎn)染慢病毒 shRNA陰性對照載體;空白對照組:不予任何處理。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前 24 h將生長狀態(tài)良好的 HT-29細(xì)胞接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞密度為 60%～75%時，實驗組和陰性對照組細(xì)胞中分別加入相應(yīng)的病毒上清液(轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù) =感染時病毒/細(xì)胞數(shù)量 =20)，收取轉(zhuǎn)染效率在 80%以上的目的細(xì)胞。③HT-29細(xì)胞中CXCR7蛋白表達(dá)檢測:采用 Western blot法，以 IODCXCR7/GAPDH計算 CXCR7蛋白的相對表達(dá)量。④HT-29細(xì)胞增殖能力檢測:采用噻唑藍(lán)(MTT)法，取值以各測試孔的 OD值減去本底 OD值為標(biāo)準(zhǔn)。⑤Transwell細(xì)胞遷移實驗:在 Transwell下室的DMEM培養(yǎng)液中加入 NIH3T3上清作為遷移誘導(dǎo)因子，在 Transwell上室滴加 200μl 1×104HT-29細(xì)胞懸液。將上室置于下室之中，在 37℃溫箱孵育。24 h后取出上室，經(jīng) PBS洗滌后，用 4%多聚甲醛固定遷移至上室外表面上的細(xì)胞，HE染色，計算遷移細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取上、下、左、右、中 5個視野(400×)細(xì)胞計數(shù)的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用 S-N-K法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HT-29細(xì)胞中 CXCR7蛋白表達(dá)水平 各組HT-29細(xì)胞中 CXCR7蛋白表達(dá)見圖1，顯示在以LV-CXCR7-shRNA轉(zhuǎn)染的實驗組 HT-29細(xì)胞中，CXCR7蛋白表達(dá)水平均低于陰性對照組和空白對照組(P均 ＜0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，提示慢病毒 CXCR7-shRNA表達(dá)載體能有效降低 HT-29細(xì)胞中 CXCR7蛋白的表達(dá)。

2.2 細(xì)胞增殖能力 各組 HT-29細(xì)胞分別于接種后第 1～5天每天以 MTT法檢測細(xì)胞密度(OD值)，見表1，并根據(jù)檢測的 OD值繪制細(xì)胞的生長曲線(圖 2)。結(jié)果顯示實驗組生長曲線較平緩，細(xì)胞生長速度較陰性對照組和空白對照組顯著降低(P均 ＜0.05);陰性對照組細(xì)胞生長曲線較空白對照組低平，提示靶向抑制 CXCR7表達(dá)有潛在抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用，同時慢病毒載體本身也可能存在細(xì)胞毒性。

表1 各組不同時間的細(xì)胞密度(OD值，±s)

表1 各組不同時間的細(xì)胞密度(OD值，±s)

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d實驗組 0.436±0.010 0.861±0.043 1.159±0.117 1.612±0.120 1.790±0.112陰性對照組 0.554±0.016 1.090±0.074 1.682±0.085 2.022±0.112 2.120±0.125空白對照組 0.596±0.022 1.200±0.050 1.895±0.083 2.146±0.098 2.213±0.095

圖1 各組CXCR7蛋白表達(dá)水平

圖2 各組細(xì)胞不同時間生長曲線

2.3 Transwell細(xì)胞遷移實驗 在 NIH3T3上清趨化作用下，遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目在實驗組、陰性對照組和空白對照組分別為(15.2±2.59)、(26.2±3.83)、(28.0±3.39)個/HP。與陰性對照組和空白對照組比較，實驗組穿透濾過膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均 ＜0.05)。提示靶向沉默CXCR7的表達(dá)明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29的遷移運動。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征與腫瘤細(xì)胞的惡性行為、轉(zhuǎn)移能力和轉(zhuǎn)移特征存在密切的關(guān)系，早期腸道腫瘤起源于正常黏膜組織，其上皮細(xì)胞異常增殖形成腺瘤，進(jìn)而穿透黏膜肌層，侵及黏膜下層，發(fā)展為惡性腫瘤，大部分的結(jié)腸癌是由腺瘤癌變而來[3]，腫瘤細(xì)胞的異常增殖和遷移是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，其促進(jìn)因子可以用來做為臨床藥物治療的靶標(biāo)。

趨化因子及其受體參與腫瘤的起源、增殖和惡化，尤其是趨化因子 CXCL12及其受體 CXCR4和CXCR7在這一進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[4]。CXCR7是2005年 Balabanian等[5]發(fā)現(xiàn)的歸巢性趨化因子 CXCL12的高親和受體，既往被命名為孤兒受體RDC1。Miao等[6]研究發(fā)現(xiàn)配體活化的 CXCR7能提高腫瘤細(xì)胞的生長、黏附和侵襲能力。Wang等[7]采用高密度組織芯片染色技術(shù)，觀察到在高侵襲性的前列腺癌組織中 CXCR7表達(dá)上調(diào);CXCR7的表達(dá)上調(diào)除了提高前列腺癌細(xì)胞株的存活優(yōu)勢外，還與增強細(xì)胞的黏附和侵襲性相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) CXCR7潛在的下游信號 CD44和鈣黏蛋白-11，可能由此提高 PCA細(xì)胞侵襲能力。Burns等用一種特異高親和力的小分子 CXCR7拮抗劑能抑制乳腺癌、肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。

本實驗采用重組慢病毒 CXCR7-shRNA表達(dá)載體來特異性沉默 CXCR7基因的表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果顯示 CXCR7蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，表明抑制 CXCR7靶基因的表達(dá)成功。MTT及 Transwell細(xì)胞遷移實驗的結(jié)果表明靶向沉默 CXCR7的表達(dá)能引起人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29的增殖和遷移活力下降，提示 CXCR7可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移作用參與結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。

目前在結(jié)腸癌的治療策略中，靶向藥物的研究空前發(fā)展，表皮生長因子受體和 VEGF的單克隆抗體西妥昔單抗和貝伐單抗已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用[8]，CXCR7與結(jié)腸癌的關(guān)系密切，具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長和遷移的作用，有望成為結(jié)腸癌治療新的分子標(biāo)靶，其作用機(jī)制需要更深入的研究。

[1]Burns JM，Summers BC，Wang Y，etal.A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival，cell adhesion，and tumor development[J].J Exp Med，2006，203(9):2201-2213.

[2]王紅鮮，陳道瑾，胡桂.shRNA慢病毒表達(dá)載體對人結(jié)腸癌細(xì)胞CXCR7表達(dá)的影響[J].中國普通外科雜志，2009，18(2):156-161.

[3]Tanaka T.Colorectal carcinogenesis:Review of human and experimental animal studies[J].J Carcinog，2009，8(2):5.

[4]Vandercappellen J，Van Damme J，Struyf S.The role of CXC chemokines and their receptors in cancer[J].Cancer Lett，2008，267(2):226-244.

[5]Balabanian K，Lagane B，Infantino S，et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes[J].J Biol Chem，2005，280(42):35760-35766.

[6]Miao Z，Luker KE，Summers BC，et al.CXCR7(RDC1)promotes breast and lung tumor growth in vivo and is expressed on tumor-associated vasculature[J].PNAS，2007，104(40):15735-15740.

[7]Wang J，Shiozawa Y，Wang J，et al.The Role of CXCR7/RDC1 as a Chemokine Receptor for CXCL12/SDF-1 in Prostate Cancer[J].J Biol Chem，2008，283(7):4283-4294.

[8]Hegde SR，Sun W，Lynch JP.Systemic and targeted therapy for advanced colon cancer[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2008，2(1):135-149.