王海彬，王東華，張鐵民（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，承德市 067000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管病變在眼部的重要并發(fā)癥[1]。從中醫(yī)學(xué)角度講，其發(fā)病辨證為陰虛為本、血瘀為標(biāo)，治以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀類中藥，臨床上可取得較好效果。本課題組利用糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜石蠟切片進(jìn)行免疫組化研究，觀察了血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白在不同組別的表達(dá)情況，旨在研究菩人丹超微粉在早期DR治療中的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

E600型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；ONE TOUCH血糖儀（強生（中國）有限公司）。

1.2 試藥

人參、丹參、制何首烏、葛根、水蛭均由河北省承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供，由河北省承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院王東華主任藥師鑒定為真品；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；苦瓜由筆者購買。

1.3 動物

健康Wistar大鼠60只，♂，體重150～200 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（津）2005-0001）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型

將STZ溶于0.05 mol·L-1檸檬酸緩沖液（pH 4.5），制備成濃度為1.25%的溶液，隨機選取50只大鼠，ip STZ 60 mg·kg-1以誘發(fā)糖尿病，另外10只作為正常組，僅ip同樣體積的檸檬酸緩沖液，注射3 d后用血糖儀測血糖，用尿糖試紙測尿糖濃度，以血糖＞16.5 mmol·L-1、尿糖（++++）、尿量以及飲水明顯增多者作為實驗對象。

2.2 菩人丹超微粉的組方和制備工藝

2.2.1 組方 苦瓜原汁10 kg，人參1 kg，丹參3 kg，制何首烏1 kg，葛根1 kg，水蛭0.3 kg。

2.2.2 制備工藝 苦瓜原汁10 kg，過濾，減壓濃縮到0.6 kg；人參、丹參，粗碎成5 mm左右顆粒，加10倍水回流提取3次，時間為2、1.5、1 h，濃縮；葛根、制首烏加10倍量70%乙醇回流提取2次，時間為1.5、1 h，濃縮；水蛭加10倍量90%乙醇回流提取2次，時間為2、1.5 h（提取溫度控制在60℃），濃縮。合并上述提取液，噴霧干燥，即得。共提取超微粉2.0 kg。

2.3 分組和給藥

實驗分為3組，即正常（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、菩人丹超微粉（15 mL·kg-1）組，ig給藥，每天1次，連續(xù)5個月，定期測血糖、尿糖和體重。5個月后輕摘眼球，留做實驗。

2.4 取材、固定和石蠟切片制作

ig 5個月后斷頸處死大鼠，處死后立即取出眼球，固定于10%福爾馬林中，48 h后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片用于免疫組化染色和HE染色。

2.5 免疫組化染色

通過脫蠟、脫水，組織修復(fù)、滴加抗體，復(fù)染，封片等完成免疫組化染色，其中抗體濃度為1∶200。

2.6 結(jié)果的測定

利用血糖儀分別測量在復(fù)制模型成功時和1個月、3個月、5個月時的各組大鼠血糖值。采用光學(xué)顯微鏡及其照相系統(tǒng)，對結(jié)果進(jìn)行觀察并照相進(jìn)行比較。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 免疫組化結(jié)果

正常組VEGF的免疫組化無陽性表達(dá)，視神經(jīng)感覺層各層均未見到明顯染色。模型組VEGF的免疫組化出現(xiàn)陽性的表達(dá)，外界膜、外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層以及視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均出現(xiàn)極棕色的染色，且染色的程度較實驗組強，面積較正常組大，外核層靠近外界膜處也出現(xiàn)染色現(xiàn)象；內(nèi)核層細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞形態(tài)改變。菩人丹超微粉組VEGF的免疫組化出現(xiàn)弱陽性改變。免疫組化圖見圖1；菩人丹超微粉對于糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜病變中VEGF蛋白表達(dá)的影響見表1。

圖1 免疫組化圖片A.正常組；B.模型組；C.菩人丹超微粉組Fig 1 Immunol histochemistry picturesA.normal group；B.model group；C.Purendan ultrafine powder group

3.2 不同時間點血糖值測定結(jié)果

表1 菩人丹超微粉對糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜病變中VEGF蛋白表達(dá)的影響Tab 1 Effects of Purendan ultrafine powder on the expression of VEGF in retina of diabetic rats

正常組血糖正常；模型組血糖顯著升高（P＜0.01）；菩人丹超微粉組血糖值顯著降低（P＜0.01）。菩人丹超微粉對糖尿病大鼠不同時間點血糖值的影響見表2。

表2 菩人丹超微粉對糖尿病大鼠不同時間點血糖值的影響Tab 2 Effects of Purendan ultrafine powder on the level of blood glucose in diabetic rats at different time points

4 討論

現(xiàn)代研究證明，VEGF在DR的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用[2，3]。視網(wǎng)膜上多種細(xì)胞均可以產(chǎn)生VEGF，作用于血管后促進(jìn)其內(nèi)皮細(xì)胞分裂，最終形成新生血管；VEGF使微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強，大分子物質(zhì)如纖維蛋白原等進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中形成纖維蛋白凝膠[4]，減慢血流速度增加血液黏稠度，增加血管堵塞的幾率。VEGF與DR之間存在著正相關(guān)的關(guān)系[5]。因此，通過觀察視網(wǎng)膜組織中的VEGF染色情況可以反過來判斷疾病的發(fā)病程度以及用藥治療后的療效。

本研究結(jié)果表明，在5個月觀察時，菩人丹超微粉組大鼠的視網(wǎng)膜病理切片免疫組化染色較模型組明顯要弱，從微觀上證明中藥菩人丹超微粉在治療DR上確實是有效的。

ig給藥5個月后，內(nèi)核層的染色相對于外核層次無論在治療組還是對照組均較強，究其原因筆者認(rèn)為是該層主要由雙極細(xì)胞、Müller等的細(xì)胞核構(gòu)成，在DR時這一層可以通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生大量VEGF[6]，從而出現(xiàn)以上結(jié)果，這與曾凱宏等[7]的研究結(jié)果是一致的；對照組外核層也出現(xiàn)了VEGF的顯色，可能是由于神經(jīng)細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的耗氧量最大，因此對缺氧相對更敏感造成的[8]。

DR屬中醫(yī)“內(nèi)障”的范疇，很多醫(yī)家認(rèn)為其病因病機是先天稟賦不足，后天調(diào)養(yǎng)失調(diào)，導(dǎo)致肝腎陰虛、陰虧燥熱、耗精灼液、血稠成瘀、脈絡(luò)不通、精氣不能上榮于目而致，氣陰虧虛是本，氣滯血瘀是標(biāo)，以“滋陰清熱、活血通絡(luò)”之法治之[9]。中藥菩人丹以人參、丹參、葛根益氣生津和活血化瘀；苦瓜清解郁熱；制何首烏補益精血、固腎益陰；水蛭祛瘀消、剔邪搜絡(luò)。諸藥協(xié)同有益氣養(yǎng)陰、調(diào)暢氣血、化瘀通絡(luò)之功。

現(xiàn)代藥理研究表明，人參含有多種化學(xué)成分，主要有人參皂苷、人參多糖、多肽、人參炔醇、麥芽酚、腺嘌呤核苷以及某些氨基酸和微量元素等，具有降低血糖、減輕體重、調(diào)節(jié)血脂、改善凝血功能等功能[10，11]?？喙虾腥祁?苦瓜皂苷、甾類-苦瓜苷等，具有降低血糖，抗氧自由基抑制β細(xì)胞凋亡作用[12]。丹參通過抗氧化作用抵抗自由基造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，下調(diào)丙二醛（MDA）含量從而對血管內(nèi)皮起到保護(hù)作用[13]。葛根對具有改善血管內(nèi)皮功能作用和改善微循環(huán)的作用[14]。近年的許多研究發(fā)現(xiàn)，水蛭及其唾液中含有多種活性成分，包括水蛭素、組胺樣物質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗血栓素等。水蛭素有拮抗凝血酶強抗凝作用，也可抑制凝血酶對內(nèi)皮細(xì)胞刺激誘導(dǎo)血管生成的作用，是凝血酶的特異性抑制劑[15]。諸藥合用具有降血糖，促使胰島細(xì)胞的恢復(fù)，保護(hù)血管內(nèi)皮，防止血栓形成和抗氧化，改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，改善視網(wǎng)膜缺氧狀態(tài)的作用。

本研究證實，VEGF在糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜中確實出現(xiàn)了陽性的表達(dá)，而且各個層次表達(dá)不一。中藥菩人丹超微粉可以有效抑制其表達(dá)，從而起到延緩或治療DR的作用，并證實了該中藥的有效性，可為臨床進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

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