郭素，劉洪玲，孫偉，孫向紅#（1.青島大學(xué)，青島市 66003；.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，青島市 66003）

?？奠`合劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，在醫(yī)院協(xié)定處方“扶正液”基礎(chǔ)上加減藥味而成的臨床上治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的有效方劑。前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明，海康靈對(duì)東莨菪堿所致AD模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能具有明顯的改善作用，其作用與抗氧化作用有關(guān)。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，筆者進(jìn)行了拆方研究，通過(guò)拆方觀察比較新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的影響，篩選出更為理想的量效關(guān)系，從而優(yōu)化處方。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Model550型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad公司）；KJWK-Ⅲ型微電腦凈化工作臺(tái)（青島康凈凈化消毒設(shè)備有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；生物安全柜（海爾集團(tuán)特種電器有限公司）；80-2型離心沉淀器（金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

?？奠`，主要含有制何首烏、黃芪、黨參、靈芝、紅景天、川芎、當(dāng)歸，生藥含量為1374 g·L-1，生藥材均由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中草藥房提供并鑒定為真品；DMEM培養(yǎng)液（含HEPES 5958 mg·L-1；青霉素 100 IU·mL-1；鏈霉素 100 μg·mL-1）、無(wú)支原體胎牛血清（優(yōu)級(jí)）均由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；PBS液、胰蛋白酶、30%過(guò)氧化氫（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司）；超純水、MTT（青島福林生物化學(xué)有限公司）；95%乙醇（山東酒精總廠藥用酒精廠）。

1.3 細(xì)胞

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞株由瑞典卡洛林斯卡醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

將?？奠`原方中單味藥材（黃芪150 g、制何首烏200 g、紅景天100 g、靈芝100 g、黨參100 g、川芎60 g、當(dāng)歸60 g）分別按常規(guī)中藥煎煮方法煎煮2次，合并2次藥液濃縮至100 mL，離心除去雜質(zhì)，加入30%乙醇沉淀12 h，過(guò)夜。上清液加熱濃縮至56 mL。用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，以原方濃度（濃度單位取mol·L-1）為基準(zhǔn)梯度稀釋藥液（濃度單位取g·mL-1），4 ℃貯藏，備用。

2.2 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)

倒置相差顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻，形態(tài)呈梭形、多觸角形。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

2.3 篩選H2O2最佳成模濃度

將SH-SY5Y細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種至96孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%時(shí)，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液換液，加入不同濃度的H2O2（終濃度分別為0、50、100、130、150、170、200 μmol·L-1，即為空白和H2O2①、②、③、④、⑤、⑥組），每個(gè)濃度設(shè)定平行的6孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加5 g·L-1MTT20 μL，于37 ℃下、5%CO2保溫箱培養(yǎng)4 h，定量吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，于測(cè)定波長(zhǎng)490 nm、參比波長(zhǎng)630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以空白組的平均吸光度值為100%，其余各組均與之比較即得細(xì)胞存活率（細(xì)胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.4 ?？奠`原方中單味藥材對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型存活率的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.3”項(xiàng)下方法操作，至96孔板細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%時(shí)，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液換液，加入不同稀釋濃度的單味藥材藥液（即①、②、③、④組），每個(gè)濃度設(shè)定平行的3個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL終濃度為150 μmol·L-1的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另設(shè)空白、模型組。用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率（細(xì)胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.5 新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)H2O2損傷細(xì)胞模型存活率影響的比較

細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.3”項(xiàng)下方法操作，至96孔板細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)70%～80%時(shí)，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液換液，分別加入新復(fù)方（濃度為0.159 g·mL-1）、原復(fù)方（濃度為0.137 g·mL-1）和單味藥（黃芪0.268 g·mL-1、制何首烏0.375 g·mL-1、靈芝 0.358 g·mL-1、黨參 0.268 g·mL-1、川芎 0.193 g·mL-1、當(dāng)歸0.161 g·mL-1）的藥液，每種藥液設(shè)定平行的3個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。每孔加入 20 μL 終濃度為 150 μmol·L-1的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率（細(xì)胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度H2O2對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞活性的影響

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后對(duì)MTT的攝取能力下降，吸光度值顯著低于空白組，表明細(xì)胞受到了損傷或部分細(xì)胞已經(jīng)死亡；在50～200 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，隨H2O2濃度的增加，細(xì)胞的存活率呈梯度下降；與空白組比較，50～130 μmol·L-1組有顯著性差異（P＜0.05），150 μmol·L-1以上濃度有極顯著性差異（P＜0.01），故選擇150 μmol·L-1H2O2作為最佳復(fù)制模型濃度。不同H2O2濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表1。

表1 不同H2O2濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

表1 不同H2O2濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白組H2O2①組H2O2②組H2O2③組H2O2④組H2O2⑤組H2O2⑥組抑制率/%12.426.236.839.840.846.151.6濃度/μmol·L-1 050100130150170200吸光度值0.876±0.0160.738±0.023＊0.632±0.038＊0.602±0.041＊0.592±0.021＊＊0.539±0.059＊＊0.484±0.037＊＊

3.2 ?？奠`中不同濃度單味藥對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

3.2.1 不同濃度黃芪、制何首烏、靈芝、紅景天藥液對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)先用4種不同濃度的黃芪藥液、制何首烏藥液、靈芝藥液、紅景天藥液孵育24 h，與模型組細(xì)胞比較，其測(cè)得的吸光度值有所變化。其中，黃芪4種濃度藥液處理后，其測(cè)得的吸光度值顯著增大（P＜0.05），說(shuō)明這4種濃度的藥物對(duì)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，故選擇吸光度值最高的藥液濃度（0.268 g·mL-1）為新組方濃度；制何首烏4種濃度藥液處理后，其測(cè)得的吸光度值顯著增大（P＜0.05），說(shuō)明這4種濃度的藥物可明顯減輕H2O2對(duì)細(xì)胞造成的損傷，故選擇吸光度值最高的藥液濃度（0.375 g·mL-1）；靈芝4種濃度藥液處理后，與模型組比較，隨濃度的增大，吸光度值也逐漸增大，與其他藥物組比較0.358 g·mL-1濃度吸光度值最高（P＜0.05），說(shuō)明靈芝0.358 g·mL-1濃度比其他濃度藥物組對(duì)細(xì)胞具有更顯著的保護(hù)作用，故選擇0.358 g·mL-1藥物組；紅景天4種濃度藥液處理后，其測(cè)得的吸光度值均減小，說(shuō)明此濃度范圍的紅景天藥液對(duì)細(xì)胞并無(wú)顯著的保護(hù)作用，故暫不做選擇。不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表2。

表2 不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

表2 不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別空白組模型組黃芪①組黃芪②組黃芪③組黃芪④組靈芝①組靈芝②組靈芝③組靈芝④組何首烏①組何首烏②組何首烏③組何首烏④組紅景天①組紅景天②組紅景天③組紅景天④組吸光度值0.7061±0.01030.5524±0.02215＊0.7790±0.03217#0.7224±0.02401#0.7427±0.0309#0.7553±0.0308#0.6381±0.03160.7002±0.01891#0.7395±0.04153#0.7807±0.03402#0.6897±0.071#0.6718±0.027#0.6540±0.0211#0.5611±0.0857#0.4737±0.05500.5494±0.026210.5197±0.043930.4578±0.02336濃度/g·mL-1- -0.2680.4020.4820.5360.1790.2680.3220.3580.3750.5360.6430.7140.1790.2680.3220.358

3.2.2 不同濃度黨參、川芎、當(dāng)歸藥液對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)先用不同濃度的黨參藥液、川芎藥液、當(dāng)歸藥液孵育24 h，與模型組細(xì)胞比較，其測(cè)得的吸光度值有所變化。其中，黨參藥液處理后，0.268 g·mL-1藥物組吸光度值較其他濃度組高，故選擇0.268 g·mL-1藥物組；川芎4種濃度藥液處理后，0.193 g·mL-1藥物組吸光度值較其他組高，故選擇0.193 g·mL-1藥物組；當(dāng)歸4種濃度藥液處理后，0.193 g·mL-1藥物組吸光度值較其他組高（P＜0.05），故選擇0.193 g·mL-1藥物組。不同濃度黨參、川芎、當(dāng)歸藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表3。

表3 不同濃度黨參、川芎、當(dāng)歸藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

表3 不同濃度黨參、川芎、當(dāng)歸藥液對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

吸光度值0.6916±0.051960.4887±0.05802＊0.5803±0.04807#0.5974±0.05444#0.5664±0.038970.4690±0.04290.5479±0.04810.6771±0.0363#0.7146±0.01014#0.6252±0.0797#0.7114±0.022960.7966±0.013060.8566±0.07783##0.8216±0.03522#組別空白組模型組黨參①組黨參②組黨參③組黨參④組當(dāng)歸①組當(dāng)歸②組當(dāng)歸③組當(dāng)歸④組川芎①組川芎②組川芎③組川芎④組濃度/g·mL-1- -0.1790.2680.3220.3580.1070.1610.1930.2140.1070.1610.1930.214

3.3 新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)H2O2損傷細(xì)胞模型存活率影響的比較

新復(fù)方組的吸光度值明顯比原復(fù)方組和其他單味藥組高（0.7813），說(shuō)明新復(fù)方組比原復(fù)方組和其他單味藥組對(duì)神經(jīng)細(xì)胞更具有保護(hù)作用，對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的修復(fù)作用。新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)細(xì)胞存活率影響的比較見(jiàn)表4。

表4 新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)細(xì)胞存活率影響的比較（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

表4 新復(fù)方與原復(fù)方、新復(fù)方與單味藥對(duì)細(xì)胞存活率影響的比較（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別空白組模型組新復(fù)方組原復(fù)方組黃芪組制何首烏組靈芝組黨參組川芎組當(dāng)歸組吸光度值0.6338±0.01530.4883±0.0084＊0.7813±0.02509#0.6328±0.02473#0.6211±0.0236#0.4926±0.024050.6913±0.0403#0.4938±0.02960.6094±0.03813#0.5658±0.0774#濃度/g·mL-1- -0.1590.1370.2680.3750.3580.2680.1930.161

4 討論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、行為異常及日常生活能力下降，主要神經(jīng)病理改變有神經(jīng)元變性、丟失引起的腦萎縮，細(xì)胞外的老年斑（Senile plaque，SP）和細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangle，NFT）[2，3]。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示，多種神經(jīng)退行性病變與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[4]。

目前，大量的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在治療老年性癡呆的各類藥物中，中藥復(fù)方因其具有療效好、副作用少、兼顧面廣、能長(zhǎng)期服用等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的重視。本次實(shí)驗(yàn)在前期研究的原有復(fù)方的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，篩選出較為理想的量效關(guān)系，進(jìn)行了拆方后重新組方的研究，采用體外神經(jīng)細(xì)胞（SH-SY5Y）培養(yǎng)，MTT比色分析的方法進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)先用0.268 g·mL-1濃度的黃芪藥液、0.375 g·mL-1濃度的制何首烏藥液、0.358 g·mL-1的靈芝藥液、0.268 g·mL-1濃度的黨參藥液、0.193 g·mL-1濃度的川芎藥液和0.193 g·mL-1濃度的當(dāng)歸藥液孵育后，能有效拮抗H2O2造成的細(xì)胞損傷（P＜0.05），細(xì)胞存活率顯著升高。

原方拆方后，篩出的濃度劑量更加合理：黃芪0.268 g·mL-1、制何首烏0.375 g·mL-1、靈芝0.358 g·mL-1（原方為0.179 g·mL-1）、黨參0.268 g·mL-1（原方為0.179 g·mL-1）、川芎0.193 g·mL-1（原方為 0.107 g·mL-1）、當(dāng)歸 0.193 g·mL-1（原方為0.107 g·mL-1）、紅景天不做選擇。依照此濃度劑量重新組成的復(fù)方與原復(fù)方和單味藥的最佳濃度劑量組對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用比較，新復(fù)方具有明顯的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明單味中藥在治療中是有局限性的，中藥復(fù)方是中醫(yī)辯證論治、理法方藥等理論的具體體現(xiàn)。中藥復(fù)方的應(yīng)用，既不是藥物作用在數(shù)量上的簡(jiǎn)單相加，也不是毒副反應(yīng)相互間機(jī)械地抵銷，而是通過(guò)藥物合理配伍產(chǎn)生出整體綜合效應(yīng)，符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的現(xiàn)代理論[5]。與單純的化合物比較，中藥在AD的防治方面具有更大的潛力[6]。

總之，本次拆方研究為下一步的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，優(yōu)化后的處方將會(huì)應(yīng)用于臨床來(lái)驗(yàn)證其療效。

[1]張 艷，陶根魚(yú).Alzheimer’s病病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)函授，2001，3：40.

[2]Ricardo B，Maccionil，Cristobal B，et al.Biological markers of Alzheimer’s disease and mild cog-nitive impairment[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：307.

[3]Nirvana S，Girish J.Molecular mechanisms，emerging etiological insights and models to test potential therapeutic interventions in Alzheimer’s disease[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：295.

[4]張均田.老年癡呆的發(fā)病機(jī)制及治療策略EJ-1[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（5）：368.

[5]羅國(guó)安，王義明.中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效相關(guān)性研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，1999，1（1）：11.

[6]朱海升，劉鄂湖.抗老年性癡呆的天然藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18（3）：225.