陳新建，楊劍，任紅梅，陳彩宇，何多芬，王旭開，王紅勇，楊成明，周林，曾春雨

腎臟是人體負責(zé)尿鈉排泄的重要器官，它通過對尿鈉重吸收的調(diào)節(jié)在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，其中多巴胺及其受體的作用尤為重要［1］。多巴胺受體按其結(jié)構(gòu)和藥理特性不同分為兩大類，即D1類受體(D1、D5)和 D2類受體(D2、D3、D4)，所有多巴胺受體都直接或間接參與腎臟的尿鈉排泄和血壓的調(diào)控［2］。D3、D4受體均為D2類受體，對腎臟尿鈉排泄及機體血壓調(diào)控發(fā)揮重要作用。我們前期研究表明多巴胺受體亞型之間具有相互作用:刺激Wistar-Kyoto(WKY)大鼠腎臟近曲小管(RPT)上皮細胞的D3受體能夠影響D1、D5受體表達及其介導(dǎo)的生理功能［3，4］。但是，D3受體對同為多巴胺D2類受體的D4受體是否具有作用目前還不清楚。本實驗利用WKY大鼠的RPT上皮細胞株為研究對象，觀察D3受體激動劑作用后對D4受體表達與功能的影響。

1 材料與方法

材料:RPT細胞株于2003-06由美國Georetown大學(xué)Dr.Pedro.Jose實驗室提供，來源于4～8周的WKY大鼠，既往實驗證實其與活體 RPT具有相同的特性［5，6］;胎牛血清與 DMEM/F12 培養(yǎng)基購至美國 Gibco公司;D3受體激動劑(PDl28907)、D3受體特異性抑制劑(U99194A)，D4受體激動劑(PD168077)、磷脂酶C抑制劑(U73122)均購自美國Sigma公司;D4受體抗體為羊抗多克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司。

細胞培養(yǎng):RPT上皮細胞在含有95%空氣和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。待細胞長至80% ～90%融合狀態(tài)用0.25%胰酶消化、傳代。

免疫印跡:藥物干預(yù)后的細胞經(jīng)過常規(guī)方法提取蛋白，測定蛋白濃度。等量總蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯膜上，室溫封閉4 h，然后與D4受體抗體(稀釋濃度為1∶400)作用，4℃孵育過夜，二抗(稀釋濃度為1∶5000)室溫孵育1 h，采用Super Signal(美國Pierce公司)顯色發(fā)光。免疫印跡結(jié)果用α-肌動蛋白(α-actin)進行校正。

細胞膜的制備:將所選細胞用D3受體激動劑PDl28907刺激24 h后，洗去D3受體激動劑PDl28907，再用10－7mol/L D4受體激動劑PD168077刺激細胞15 min，測定D4受體激動劑PD168077對RPT上皮細胞的Na+-K+-ATP酶(ATP為三磷酸腺苷)活性的影響(與單獨D4受體激動劑PD168077作用相比)。細胞膜懸液采用等滲、低溫高速離心法進行制備。

Na+-K+-ATP酶活性測定:酶活性測定采用哇巴因法，鉬酸銨硫酸亞鐵顯色定磷后，740 nm處比色，用分光光度法測定產(chǎn)生的無機磷含量，其中無哇巴因存在下產(chǎn)生的無機磷為總ATP酶活性，有哇巴因存在下產(chǎn)生的為Mg+-ATP酶，兩者之差為Na+-K+-ATP酶活性。其中，以對照活性為100%。

統(tǒng)計學(xué)方法:計量資料以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組以上的比較采用ANOVA法進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D3受體激動劑PDl28907對Wistar-Kyoto大鼠腎臟近曲小管上皮細胞D4受體表達的影響

利用不同濃度D3受體激動劑PD128907(10－10～10－6mol/L)作用RPT上皮細胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D3受體激動劑PD128907能夠有效增強RPT上皮細胞中D4受體蛋白表達，該作用呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，10－9～10－6mol/L與對照(不加任何藥)比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(圖1)

利用D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)分別刺激 RPT 上皮細胞不同時間(4 h、8 h、16 h、24 h、30 h)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D3受體激動劑PD128907對RPT上皮細胞中D4受體蛋白表達的影響也呈現(xiàn)時間依賴性關(guān)系，4 h、8 h、16 h、24 h、30 h 與對照(0 h)比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(圖2)

預(yù)先用D3受體抑制劑U99194 A(10－6mol/L)共刺激作用下，發(fā)現(xiàn) D3受體激動劑 PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達的促進作用受到阻斷，單獨的D3受體抑制劑U99194 A對D4受體蛋白表達與對照(不加任何藥)比沒有變化。單獨的D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達均高于對照(不加任何藥)、單獨U99194 A及PD128907+U99194 A，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(圖3)

利用磷脂酶C抑制劑U73122(10－7mol/L)預(yù)先孵育細胞，再與D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)單獨或共刺激RPT上皮細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在磷脂酶C抑制劑 U73122存在的情況下，D3受體激動劑PD128907刺激D3受體后對D4受體的促進表達效應(yīng)受到顯著抑制。單獨的 D3受體激動劑 PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達均高于對照(不加任何藥)、單獨U73122及PD128907+U73122，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(圖4)

圖1 不同濃度D3受體激動劑PDl28907(10－10～10－6mol/L)對D4受體蛋白表達的影響。與對照比*P＜0.05，n=5

圖2 D3受體激動劑PDl28907(10－7mol/L)不同作用時間對D4受體蛋白表達的影響。與對照比*P＜0.05，n=5

圖3 被D3受體抑制劑U99194A刺激后，D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白表達的影響。與其它3項比*P ＜0.05，n=8

圖4 被磷脂酶C抑制劑(U73122，10－7mol/L)刺激后，D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)對D4受體蛋白的影響。與其它3項比*P＜0.05，n=8

2.2 D3受體激動劑PD168077對腎臟近曲小管上皮細胞中D4受體介導(dǎo)的Na+-K+-ATP酶活性抑制功能的影響

單獨的D4受體激動劑PD168077刺激細胞15 min后，Na+-K+-ATP酶的活性為77%，與對照100%比較明顯受到抑制(P＜0.05，n=5);利用D3受體激動劑PD128907(10－7mol/L)刺激24小時后，再用D4受體激動劑PD168077刺激D4受體，則使得Na+-K+-ATP酶活性進一步降低為62%，與對照100%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，n=5)。

3 討論

腎臟是人體負責(zé)尿鈉排泄的主要器官，它通過對尿鈉重吸收的調(diào)控作用在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，其中多巴胺及其受體的作用尤為重要。RPT是多巴胺分泌的部位，也是主要的作用部位，當(dāng)體內(nèi)鈉負荷過載時，多巴胺通過抑制RPT對尿鈉的重吸收，在腎臟尿鈉排泄中發(fā)揮重要作用［7，8］。多巴胺受體根據(jù)結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特性不同分為D1類(D1和D5)受體和D2類(D2，D3，D4)受體［9］。以往研究大多集中于多巴胺D1類受體，對多巴胺D2類受體研究較少。不過，近年來的研究表明，屬于多巴胺D2類受體的多巴胺D3與D4受體在腎臟尿鈉排泄中均具有重要作用。

D3受體與D4受體均為多巴胺D2類受體中的亞型之一，在腎臟中的近曲小管、遠曲小管、皮質(zhì)集合管、腎小球以及腎臟血管等均有表達，這兩種多巴胺受體亞型均對腎臟尿鈉排泄具有促進作用［10，11］。研究發(fā)現(xiàn)D3受體突變小鼠(D3-/-)與 D4受體突變小鼠(D4-/-)的血壓也均明顯高于野生型小鼠［12，13］。同時，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)了在WKY大鼠腎臟中，刺激D3受體可明顯增加D3/Ga12受體及D3/Ga13受體之間的連接程度，這將有利于腎臟尿鈉排泄［14］;在WKY的RPT細胞中，刺激D3受體可顯著抑制血管緊張素1型受體(AT1受體)的表達，這也有利于抑制血管緊張素1型受體介導(dǎo)的尿鈉潴留作用［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，在多巴胺D1類和D3類受體之間存在協(xié)同作用，刺激RPT細胞的D3受體能夠影響D1、D5受體表達及其介導(dǎo)的生理功能［3，4］。但是，同屬于多巴胺D2類受體的D3受體與D4受體是否也具有相互作用并不清楚。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，利用D3受體激動劑PD128907作用于WKY大鼠的RPT上皮細胞可以顯著促進D4受體的表達，提示D3受體可能通過影響D4受體的表達從而影響D4受體介導(dǎo)的生理學(xué)功能。

在以往研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn) D4受體激動劑PD168077作用WKY的RPT細胞后，可以明顯抑制RPT細胞的Na+-K+-ATP酶活性，從而抑制腎小管尿鈉重吸收，有利于腎臟尿鈉排泄［10］。因此，我們在發(fā)現(xiàn)D3受體增強D4受體的表達后繼續(xù)研究了該效應(yīng)是否影響了D4受體介導(dǎo)的尿鈉排泄功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于單獨刺激D4受體的作用而言，在D3受體預(yù)先刺激24小時的情況下，D4受體激動劑PD168077對RPT上皮細胞的Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用有所增強，提示D3受體對D4受體介導(dǎo)的對Na+-K+-ATP酶活性的抑制效應(yīng)同樣具有促進作用。這進一步說明D3受體在RPT可以通過改變D4受體表達，進而對D4受體功能產(chǎn)生影響，從而改變D4受體介導(dǎo)的促尿鈉排泄功能。

研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶C在多巴胺受體介導(dǎo)的多個信號途徑中發(fā)揮了重要作用。多巴胺D1類受體激動劑在哺乳動物腦部可以通過磷脂酶C信號從而在磷酸肌醇信號途徑中發(fā)揮作用［16］。多巴胺D1與D2受體共刺激后可以通過磷脂酶C途徑及其下游鈣離子信號通路從而在受體功能上發(fā)生相互關(guān)聯(lián)［17］。因此，我們推測D3受體很可能也通過磷脂酶C信號途徑增強D4受體的表達及其介導(dǎo)的生理功能。我們預(yù)先使用磷脂酶C抑制劑U73122作用RPT上皮細胞后，發(fā)現(xiàn)D3受體激動劑PD128907促進D4受體表達的效應(yīng)作用受到明顯抑制，提示在WKY的RPT上皮細胞中D3受體對D4受體的增強作用可能與磷脂酶C信號途徑有關(guān)。

綜上所述，刺激D3受體可以促進D4受體表達及其介導(dǎo)的促尿鈉排泄功能而發(fā)揮對血壓的調(diào)控作用，該作用可能通過磷脂酶C信號途徑完成。

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