高 麗，徐長亮，何赟綿，奚 濤

中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210009

血管生成擬態(tài) (vasculogenic mimicry，VM)是1999年由Maniotis AJ等發(fā)現(xiàn)的一種存在于惡性腫瘤中的獨(dú)特的血液供應(yīng)方式，即由侵襲性腫瘤細(xì)胞相互連接、以細(xì)胞外基質(zhì)分隔而成，可輸送血液的管道結(jié)構(gòu)[1]。腫瘤的這種生物學(xué)特性有利于腫瘤細(xì)胞的快速生長和轉(zhuǎn)移。近幾年研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA(Tan IIA)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷、誘導(dǎo)分化和凋亡等作用。為進(jìn)一步研究丹參酮ⅡA的抗癌作用，我們研究了其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖及體外VM的影響，并分析了可能的作用機(jī)制。

1 材 料

丹參酮ⅡA（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99%）；人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由中國藥科大學(xué)郭青龍教授惠贈(zèng)；胎牛血清、Leibovitz L-15培養(yǎng)液（Gibico 公司）；胰蛋白酶（Sigma 公司）；人工基質(zhì)Matrigel（BD公司）；鼠抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）抗體（美國 Santa cruz抗體公司）；HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清及100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的L-15培養(yǎng)液，在無CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定Tan IIA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

將細(xì)胞以每孔7.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h證實(shí)貼壁后去掉培養(yǎng)基，加入不同濃度的 Tan IIA （0、4、8、12、16、20、40、80、120 μmol·L-1），陰性孔加入含0.3%DMSO的無血清培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照，每孔200μL，細(xì)胞培養(yǎng)48h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入 5mg·mL-1MTT20μL，孵育 4 h。 棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸收值(A值，以630 nm為參比波長)，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。每個(gè)劑量濃度設(shè)3個(gè)平行孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。

MDA-MB-231作用48 h時(shí)，各劑量組A值均小于細(xì)胞對(duì)照組，抑制率分別為3.79%、15.9%、22.4%、40.6%、54.6% 、84.2%、92%、94.4%，均有顯著差異(P＜0.01)，且其效應(yīng)呈質(zhì)量濃度依賴性（見圖1）。表明丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 管道形成實(shí)驗(yàn)

于96孔板中每孔加50 μL預(yù)先于4℃過夜的Matrigel,在 37℃條件下溫育 30 min使 Matrigel凝固，分別將含不同濃度的 Tan IIA(0、2.5、5、10 μmol·L-1)的無血清培養(yǎng)基和無血清饑餓12 h的MDAMB-231細(xì)胞(2.5×104cell/孔)混勻后加入培養(yǎng)板，每組3孔，每孔200 μL。培養(yǎng)7 h后，拍照并觀察小管形成情況。

在Matrigel上，MDA-MB-231能模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞樣的特性，細(xì)胞之間互相連接，約12h后呈單個(gè)環(huán)狀或多個(gè)環(huán)相連的網(wǎng)格狀。對(duì)照組、丹參酮ⅡA組細(xì)胞于體外均可以形成管道狀結(jié)構(gòu)，但對(duì)照組所形成的管道結(jié)構(gòu)排列較丹參酮ⅡA組整齊，且較多而完整(見圖2)。于顯微鏡下觀察，對(duì)照組平均每視野管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著高于丹參酮ⅡA組。

圖2 丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231擬血管形成的作用

2.4 半定量RT-PCR檢測血管生成擬態(tài)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)及灰度分析

各組細(xì)胞用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。VEGF上游引物 5′-ACCCATGGCAGAAGGAGG-3′，下游引物 5′-CTTACCGCCTCGGCTT-3′，該對(duì)引物能擴(kuò)增出VEGF121、VEGF165兩個(gè)產(chǎn)物。內(nèi)參GAPDH：上游引物 5′-AAGGTCGGAGTCACCGGATT-3′， 下游引物 5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。PCR 程序?yàn)?94℃ 5 min→(94℃ 30 s→60℃ 40 s→72℃ 40 s)×28 cycles→72℃ 10 min→4℃。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)攝片。Quantity One軟件對(duì)凝膠電泳條帶和感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值代表目的基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

GAPDH作為內(nèi)參以保證在相等的mRNA含量下進(jìn)行比較。灰度相對(duì)值=（VEGF121灰度值+VEGF165灰度值）/GAPDH灰度值。如圖3所示，灰度相對(duì)值分別為 0.502±0.022、0.414±0.015（P＜0.01）、0.361±0.020（P＜0.01）。 與對(duì)照組相比，丹參酮ⅡA 組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)量降低，且具有顯著性差異。

圖3 丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)VEGF121、VEGF165 mRNA表達(dá)的影響

2.5 Western blot檢測VEGF蛋白的表達(dá)

冷PBS洗細(xì)胞2次，加蛋白裂解液制備總蛋白，超聲破碎后 12000 r·min-1，離心 10 min，取上清，采用BCA法定量蛋白濃度。取總蛋白100 μg于100℃加熱變性5 min后上樣，行穩(wěn)壓SDS-PAGE電泳，穩(wěn)流半干電轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h后 TBST漂洗 5×10 min，加入適當(dāng)濃度一抗(VEGF 1∶400、β-action 1∶500)4℃孵 育 過 夜 。 次 日TBST漂洗5×10 min后再加HRP標(biāo)記的二抗(羊抗鼠1∶5000)室溫孵育 1h，TBST 漂洗 5×10min。 ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影。所有數(shù)據(jù)均在SAS 9.1.3軟件下分析，以±s表示，分別采用單因素及多因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Western blot結(jié)果如表1所示，丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)的影響與對(duì)mRNA表達(dá)的影響一致。當(dāng)?shù)⑼駻的濃度達(dá)到5 μmol·L-1，與對(duì)照組的差異具有顯著性（P＜ 0.01）。

3 討 論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，在惡性度較高的腫瘤中,為了滿足腫瘤細(xì)胞快速生長的需要,腫瘤細(xì)胞通過自身的變形與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用模仿血管壁結(jié)構(gòu)（血管生成擬態(tài)），形成可輸送血液的管道系統(tǒng),并與宿主血管相連，使腫瘤獲得足夠的血液供應(yīng)[2]。故VM可能是多種惡性腫瘤為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種新的血液供應(yīng)模式。腫瘤組織內(nèi)早期血供主要來自VM,隨著體積增大,在VM和以內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管之間出現(xiàn)馬賽克血管,前兩者逐漸被內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管替代,并成為腫瘤血供的主要方式[3]。因此，在腫瘤早期最大限度地抑制VM,可以更好地為抑制腫瘤血供創(chuàng)造條件。

研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞形成血管擬態(tài)的機(jī)制與內(nèi)皮 相 關(guān) 基 因 Tie-1、 Tie-2、VE-cadherin、EphA2、Laminin5-T2、MMPs、VEGF-C、LYVEl、TF、NOTCH[4]和Mig-7[5]等蛋白的生物活性有關(guān)。其中VEGF及其受體是刺激腫瘤血管生成的最強(qiáng)的細(xì)胞因子。大量臨床研究顯示VEGF的高表達(dá)與腫瘤微血管密度、惡性程度、患者預(yù)后不良密切相關(guān)[6]。朱芳等[7]通過觀察多種腫瘤細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)現(xiàn)象的能力，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)量低的細(xì)胞不能形成血管擬態(tài),VEGF表達(dá)量高的細(xì)胞雖不一定能形成血管擬態(tài),而能形成血管擬態(tài)的細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)都較高。因此,只有VEGF表達(dá)高的細(xì)胞才有形成血管擬態(tài)的潛能。MDA-MB-231細(xì)胞為內(nèi)腔間質(zhì)細(xì)胞樣惡性癌細(xì)胞，生長速度較快，具有很高的侵襲性，為VEGF高表達(dá)細(xì)胞。它們?cè)贛atrigel的體外培養(yǎng)中，能形成大的星狀突出結(jié)構(gòu)[8-9]。

表1 Western-blot結(jié)果分析

丹參酮ⅡA是丹參發(fā)揮藥效的重要活性成分。研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用與其調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)[10]。我們發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞在體外能夠形成管狀結(jié)構(gòu)，丹參酮ⅡA對(duì)該細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,且抑制其體外管狀結(jié)構(gòu)的形成。隨后為初步探討其作用機(jī)制,我們檢測了丹參酮ⅡA對(duì)該細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，推測丹參酮ⅡA可能通過抑制VEGF信號(hào)通路來抑制VM形成。該研究對(duì)丹參酮ⅡA應(yīng)用于抗腫瘤治療提供了新的理論依據(jù)。

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