顧麗娟，楊大龍，冷柏榕，嚴(yán)相平*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南京 210029；2南京工業(yè)大學(xué)江蘇省藥物研究所，南京 210009

五維牛磺酸口服液是多種維生素的復(fù)合制劑，主要成分有水溶性維生素B1、B2、B6、煙酰胺和脂溶性維生素D2、?；撬?，主要用于維生素B族缺乏所致疾病的輔助治療。4種水溶性維生素作為主要成分應(yīng)加以定量控制，而我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)[1]以液相色譜法僅對維生素B1、B6、煙酰胺含量進(jìn)行測定。該標(biāo)準(zhǔn)采用流動相為0.9%三乙胺溶液-0.5%磷酸乙腈溶液（400：1），流動相中水相比例過高，這對于碳十八柱壽命不利，且不易重現(xiàn)。盡管有文獻(xiàn)報道[2-4]采用HPLC法同時測定上述4種維生素，然而本品作為營養(yǎng)藥，在處方中含有尼泊金乙酯做防腐劑，用文獻(xiàn)報道條件試驗(yàn)時，防腐劑出峰時間過長（約1.5h），無法用于本品含量測定。另有部分文獻(xiàn)采用梯度洗脫，操作繁瑣。本文建立了一個新的色譜條件，同時測定五維?；撬峥诜褐械纳鲜?中水溶性維生素的含量。

1 儀器和試藥

ALLTECH 626高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)；流動相：甲醇-0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉溶液 （含0.1%冰醋酸）（50： 50）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：273 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按維生素B1峰計算應(yīng)不低于2000。色譜圖見圖1。

2.2 溶液配制

對照品溶液：精密稱取維生素B1對照品約16 mg、煙酰胺對照品約9.6 mg，置同一100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻（溶液A）。精密稱取維生素B6對照品約12.8 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻（溶液B）。精密稱取維生素B2對照品約10.4 mg置100 mL量瓶中，加冰醋酸1 mL與水75 mL，加熱溶解后，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻（溶液C）。精密量取溶液A 10 mL，溶液B、C各5 mL置同一100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。

供試品溶液：精密吸取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。

2.3 線性試驗(yàn)

圖1 HPLC色譜圖

精密量取“2.2”項(xiàng)下溶液A10mL，溶液B、C各5 mL，置同一50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此溶液4、4.5、5、5.5、6、6.5、7mL， 置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣測定，以相應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，以各組分峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程分別為：VB1，A=-9.335×103+2.197×104C， r=0.9996； VB2，A=4.954×103+6.461×104C， r=0.9998； VB6，A=1.103×103+1.229×104C，r=0.9998； 煙酰胺，A=4.123×103+1.268×104C， r=0.9997。結(jié)果表明，4個組分的線性范圍分別為12.57～21.99、2.07～3.63、2.52～4.40、2.52～4.40 μg·mL-1。

2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與中間精密度試驗(yàn)

取樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算得維生素 B1、B2、B6和煙酰胺這 4個成分峰面積RSD分別為1.05%、1.94%、0.93%和0.74%。

取對照品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄峰面積，考察溶液放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同一批號的本品（批號080621），共6份，照“樣品測定”法項(xiàng)下操作，測定每份樣品的含量，計算得4個成分的RSD分別為0.48%、0.89%、0.67%和1.18%。

取同一批號本品（批號0809261），分別由二位實(shí)驗(yàn)者在不同的時間內(nèi)，分別測定含量。計算得中間精密度RSD分別為0.82%、0.77%、0.44%和0.36%。

2.5 回收率試驗(yàn)

按處方工藝，分別以處方量的80%、100%、140%的濃度比例，精密稱取各原料、配制低中高濃度的模擬樣品1000 mL。按照“樣品測定”項(xiàng)下的方法測定含量。計算得平均回收率分別為99.8%、99.7%、99.4%和99.4%，RSD(n=9)分別為0.76%、0.92%、0.28%、0.49%。

2.6 樣品測定

取3批供試品溶液進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

3 討 論

文獻(xiàn)報道的流動相中均含有庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉等離子對試劑，可見離子對試劑的使用對于分離測定上述四種維生素是有意義的。具體到本品，由于處方中以尼泊金乙酯為防腐劑。當(dāng)有機(jī)相的比例較低時，保留時間過長。而幾種維生素的極性都較大，有機(jī)相增加時，出峰太快，彼此間無法分離。而離子對試劑的引入能夠有效解決這一矛盾：尼泊金乙酯不具備與離子對試劑結(jié)合的基團(tuán)，其色譜行為主要與有機(jī)相的比例密切相關(guān)；而幾種維生素都具堿性氮原子，能夠與離子對試劑結(jié)合形成離子對，使得其疏水性增強(qiáng)，從而色譜保留增強(qiáng)，并得以彼此分離。通過調(diào)整離子對試劑的種類、用量、有機(jī)相的比例，達(dá)到了如下目的：四種主成分保留時間適當(dāng)，分離良好，且尼泊金乙酯出峰時間不過長。

表1 含量測定結(jié)果（%）

[1] 國家藥典委員會.WS-10001-(HD-1442)-2003.五維牛磺酸口服液[S].

[2] 劉曉琳，武 谷，鐘淮濱.HPLC法測定復(fù)合維生素B溶液中維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺的含量[J]. 中國藥事，2003，17(4):241-2.

[3] 陸幗蓉，王桂珍.RP-HPLC法測定復(fù)合維生素B片中維生素B1、B2、B6和煙酰胺的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1995，26(3)：177-9.

[4] 王學(xué)艷，張伯穎.復(fù)合維生素B注射液中四種水溶性維生素的離子對-HPLC測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（5）：378-80.