王 麗,崔曉如,竇穎輝,聞 俊,杭太俊,范國榮*

(1.中國藥科大學藥學院藥物分析學教研室,南京 210009;2.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室,上海 200433)

丹參素(danshensu)又名D(+)-β-(3,4-二羥基苯基)-乳酸,是從唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的根中提取分離的一種酚性芳香酸類化合物,是丹參的主要有效成分之一,具有保護心肌、抗血栓、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。近年來,中藥的藥動學研究已經(jīng)成為藥學研究的一個熱點,目前已有多篇以丹參素作為指標成分的藥動學研究,不過這些文獻中多采用 HPLC[2]、HPLC/MS/MS[3]、在線固相萃取-HPLC法[4]、在線固相萃取-HPLC/MS/MS法[5]、膠束毛細管電泳法[6]和熒光光譜法[7]等方法,上述方法中樣品前處理較為復雜耗時,分析時間較長或檢測限較高,不適于大量生物樣品的分析。本研究在文獻方法的基礎上進行了優(yōu)化,建立了一種簡便、快速的新型在線固相萃取-HPLC法測定犬血漿中丹參素的濃度。

1 儀器、試藥和動物

島津超高效液相色譜儀:LC-20AD型泵,SIL-20A型自動進樣器,CTO-20AC型柱溫箱,SPD-20A型紫外可見檢測器,DGU-20A3型脫氣機,LV-306R型自動高壓切換閥及LC-solution色譜工作站(日本島津公司)。XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠),Thermo CR3i冷凍離心機(美國熱電公司)。HA-202M電子天平(日本A&D公司)。丹參素對照品(含量103%,批號:20081103-2-1)由第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心提供;內(nèi)標對羥基苯甲酸對照品(含量99%,批號:H0207)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。氯化鈉注射液購自上海百特醫(yī)療用品有限公司,乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。比格爾犬6條,雌雄各半,犬齡6～8個月,體重9～10 kg,由上海新岡實驗動物場提供,實驗動物合格證號:SCXK(滬)2007-0009。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 富集柱 Lichrospher C18柱(37 mm ×4.6 mm,25 μ m),分析柱 Ultimate XBC18柱 (50 mm ×4.6 mm,5 μ m);富集流動相:乙腈-10 mmol/L NaH2PO4(5∶95),流速 2 ml/min;分析流動相:乙腈-10 mmol/L NaH2PO4(11∶89),流速0.8 ml/min;切換時間0.2 min,切回時間3.0 min,分析時間 5 min;檢測波長 285 nm;進樣量 100 μ l。

2.2 溶液配制 (1)丹參素標準溶液 精密稱取丹參素對照品10 mg,置于10 ml棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為1 mg/ml的丹參素對照品貯備液。以40%甲醇稀釋該貯備液獲得濃度依次為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μ g/ml的丹參素系列濃度標準溶液,4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?2)內(nèi)標工作溶液 精密稱取對羥基苯甲酸對照品10 mg,置于10 ml棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為1 mg/ml的內(nèi)標貯備液。同樣以40%甲醇稀釋得1 μ g/ml的內(nèi)標工作溶液,4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 在線固相萃取過程 在線固相萃取系統(tǒng)示意圖見圖1[8]。在線固相萃取過程主要是通過一個切換閥來實現(xiàn)的。當切換閥在1號位時,樣品先進入富集柱,經(jīng)富集流動相沖洗,使血漿中的干擾大分子和其他水溶性雜質(zhì)被沖掉,而被測物保留在柱子上。轉(zhuǎn)動切換閥至0號位,此時富集柱和分析柱成串聯(lián)狀態(tài),分析流動相把樣品從富集柱上反沖進入分析柱,進行分離測定。最后切回切換閥至1號位,分析流動相繼續(xù)對被測物進行分析,富集流動相沖洗并平衡富集柱,等待下次進樣。

2.4 血漿樣品預處理 取犬血漿樣品0.1 ml,加入內(nèi)標工作溶液 10 μ l,渦旋混勻,加入 6%高氯酸溶液80 μ l,渦旋混合3 min,2.125 5×104×g離心10 min,取上清液100 μ l進樣分析。

圖1 在線固相萃取系統(tǒng)示意圖[8]Figure 1 Schematic diagram of the on-line SPE system using a six-port switching valve(step 1,valve 1;step 2,valve0;step 3,valve 1)

2.5 標準曲線與線性范圍 取比格爾犬空白血漿90 μ l,共7份,分別加入丹參素系列濃度標準溶液10 μ l,制得相當于丹參素濃度分別為 20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml標準含藥血漿樣品。按2.4項下操作,以丹參素濃度(c)為橫坐標,丹參素與內(nèi)標峰面積比值(Y)為縱坐標,用最小二乘法進行加權(quán)線性回歸,得回歸方程為Y=6.120×10-3c+6.907×10-3,r=0.999 6(n=7)。在20～2000 ng/ml濃度范圍內(nèi)血漿藥物濃度與峰面積比值線性關系良好。定量下限為20 ng/ml。

2.6 方法專屬性 以2.1項下色譜條件測得空白血漿、空白血漿標準添加丹參素和對羥基苯甲酸及給藥后血漿樣品的色譜圖見圖2。由圖2可見,丹參素和對羥基苯甲酸的保留時間分別約為2.5、4.3 min,內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾丹參素和對羥基苯甲酸的色譜分離。

2.7 精密度及相對回收率實驗 取空白血漿15份分為3組,分別制備含50、200和 1 600 ng/ml 3種濃度的含藥血漿樣品,各5份。按2.4項下方法處理后1 d內(nèi)連續(xù)進樣,計算得日內(nèi) RSD分別為5.82%、2.40%、2.45%(n=5);連續(xù)測定3d,計算得日間 RSD分別為 6.35%、2.37%、6.06%(n=3)。3種濃度的丹參素含藥血漿樣品的相對回收率分別為(100.07±6.35)%、(106.86±2.54)%、(105.90±6.42)%(n=15)。

2.8 絕對回收率實驗 同上配制低、中、高濃度的含藥血漿樣品,按2.4項下方法處理并測定,測得的丹參素峰面積與等濃度丹參素溶液直接進樣所得峰面積作比,得3種濃度血漿樣品的絕對回收率分別為80.05%、80.21%和84.89%(n=5)。

圖2 比格爾犬血漿中丹參素的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of danshensu in beagle dog plasma

2.9 穩(wěn)定性實驗 同上配制50、1 600 ng/ml的含藥血漿樣品,按2.4項下方法處理后分別進行穩(wěn)定性實驗。分別考察血漿樣品在室溫放置2 h、進樣器放置10 h、凍融3次和-20℃冷凍放置20 d的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。結(jié)果表明丹參素血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定。

表1 丹參素血漿樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果T able 1 Stability test results of danshensu in beagle dogplasma

2.10 稀釋效應實驗 靜脈給藥時部分血漿樣品中藥物濃度較高,部分犬血漿樣品需要稀釋,因此要考察丹參素血漿樣品的稀釋效應。由于血漿樣品直接稀釋到相應濃度會引起較大的操作誤差,本實驗以1/2、1/5為基數(shù)對血漿樣品做相應的稀釋。配制血漿標準曲線樣品和血漿質(zhì)量控制樣品,并配制稀釋至1/2、1/5、1/10、1/100后的中濃度和高濃度血漿質(zhì)量控制樣品各5份,按2.4項下方法處理后分別進樣,計算得血漿樣品經(jīng)過稀釋后,其相對偏差值均＜6%,符合生物樣品分析測定要求,說明高濃度血漿樣品經(jīng)稀釋后測定結(jié)果不影響其實際血藥濃度。

2.11 比格爾犬體內(nèi)血藥濃度測定 健康成年比格爾犬6只,雌雄各半,依次稱重,按10 mg/kg的劑量靜脈注射丹參素氯化鈉注射液,分別于給藥前及給藥后0、2、5、10、20 、40 min,以及 1、1.5 、2、3、4、6、8、12 h在比格爾犬一側(cè)后肢靜脈取血2 ml,置肝素鈉抗凝離心管中,離心(4.555×103×g)10 min,分取上層血漿,-80℃避光保存。取血漿樣品,按2.4項下方法處理并測定,按標準曲線方程計算各時間點血漿藥物濃度,結(jié)果見圖3。

圖3 比格爾犬單劑量靜注10 mg/kg丹參素后的藥-時曲線Figure3Mean drug plasma concentration-time curve of danshensu after single intravenous dose of 10 mg/kg in beagle dogs;n=6

3 討 論

3.1 富集流動相的選擇 富集流動相常以水溶性溶液為主,以除去部分蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源性水溶性雜質(zhì)并使被測組分保留在富集柱上。但由于犬血漿樣品中干擾物質(zhì)較多,故在富集流動相中加入低比例乙腈,更有利于除去血漿中的干擾物質(zhì)。

3.2 預處理方法的選擇 在線固相萃取技術(shù)允許血漿樣品直接進樣,但血漿樣品內(nèi)大量蛋白質(zhì)及內(nèi)源性雜質(zhì)會使柱子阻塞、柱壓升高,影響柱子的柱效并減少柱子的使用壽命。因此在實際操作過程中,通常用沉淀法除去血漿樣品中的部分蛋白質(zhì)后再進樣分析,既提高分離效果,又延長柱子使用壽命。

3.3 切換時間和切回時間的選擇 在線固相萃取時切換時間較短,富集流動相的流速較大,以有利于在短時間內(nèi)沖掉大部分蛋白質(zhì)并使被測物保留在富集柱上。選擇合適的切回時間,有利于被測物完全轉(zhuǎn)移至分析柱并有充足的時間平衡富集柱。因此選擇0.2 min作為切換時間,3.0 min作為切回時間,整個分析時間5 min。

3.4 富集柱的選擇 富集柱的長度應適宜,防止高流速時兩根柱子串聯(lián)造成極高的柱壓;富集柱填料的粒徑應適宜,既利于沖掉大分子蛋白質(zhì),又利于保留被測物。因此選擇了自制 Lichrospher C18柱(37 mm×4.6 mm,25 μ m)作為富集柱。

本研究采用在線固相萃取-HPLC法測定比格爾犬血漿樣品中丹參素的濃度,使樣品的純化、富集與分析同步進行,操作簡單,提取效率高,分析時間短,適于大量生物樣品的分析。

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