楊 柳,陳承杰,辛海量,李 敏*

(1.第二軍醫(yī)大學海醫(yī)系軍隊衛(wèi)生學教研室,上海 200433;2.上海市青浦區(qū)疾病預防控制中心五大衛(wèi)生科,上海 201700;3.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院中醫(yī)科,上海 200433)

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)系馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質(zhì)草本植物,是藥食同源野生植物之一,既有保健功能,又有藥用價值。研究表明,馬齒莧能降低家兔體內(nèi)的血清脂質(zhì)和血黏度,具有抗動脈粥樣硬化和抗缺氧作用[1]。本研究自制馬齒莧提取物,對其清除自由基的活性進行體外研究,為充分開發(fā)利用這一天然資源提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(魯伊科工貿(mào)公司);751型分光光度計(上海精密科學技術有限公司);TG332A型微量分析天平(上海天平儀器廠);H Y31-02電熱恒溫水浴鍋(紹興醫(yī)療器械廠),T/UT6030恒溫干燥箱和Labofuge400R高速低溫離心機(德國 Heraeus公司)。1,1-二苯基-2-(2′,4′,6′-三硝基苯基)肼(DPPH)(日本東京和光純藥工業(yè)株式會社);無水乙醇、95%乙醇(分析純)、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸均購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司;羥基自由基測試盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-?)測試盒均購自南京建成生物工程研究所;2,6-二叔丁基對甲酚(BH T)(含量99%,南京大唐化工有限責任公司,批號090603);沒食子酸對照品(批號110831-200302)和維生素C(批號100425-200702)均購自中國藥品生物制品檢定所;馬齒莧藥材(批號090728)購自上海雷允上藥業(yè)有限公司,經(jīng)第二軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室鄭漢臣教授鑒定為馬齒莧科馬齒莧。

2 方 法

2.1 馬齒莧提取物的制備 稱取馬齒莧藥材500 g,用4000 ml 80%乙醇回流提取2次,每次1 h。合并提取液,減壓除乙醇,加蒸餾水至1 g生藥/ml,用10%NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH6.5～7.0,以2×103×g離心4 min,得沉淀,水洗沉淀物,繼續(xù)離心,沉淀經(jīng)干燥。將最終所得沉淀溶于無水乙醇中,分別配置成不同濃度的馬齒莧樣品液,待用。

2.2 清除DPPH自由基實驗 準確稱取25 mg DPPH置250 ml容量瓶中,用80%乙醇溶解并定容,配置成0.1 mg/ml的DPPH溶液。將2 ml不同濃度馬齒莧樣品液及2 ml DPPH溶液加入到同一支具塞試管中,搖勻。30 min后在 517 nm處用2 ml 80%乙醇作參比劑測定其吸光度Ai,同時測定2 ml DPPH溶液與2 ml 80%乙醇混合后吸光度A0、2 ml不同濃度馬齒莧樣品液與2 ml 80%乙醇混合后的吸光度Aj。評價實驗樣品的抗氧化能力的大小用清除率來表示。清除率計算公式:P1=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。陽性對照藥選擇沒食子酸,同法操作,并計算清除率。

2.3 清除羥基自由基實驗 嚴格按照羥基自由基試劑盒說明書操作。選擇維生素C作為陽性對照藥,同法按照試劑盒說明書操作,測定吸光度。清除率計算公式:P2=[(對照管的吸光度-測定管的吸光度)/對照管的吸光度]×100%。

2.4 抑制超氧陰離子自由基(O2-?)實驗 嚴格按照超氧陰離子自由基試劑盒說明書操作。選擇維生素C作為陽性對照藥,同法按照試劑盒說明書操作,測定吸光度。清除率計算公式同2.3項。

2.5 測定還原能力實驗 取0.5 ml不同濃度的馬齒莧樣品溶液分別置 10 ml比色皿中,加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 ml,1%的鐵氰化鉀溶液2.5 ml,混勻,50℃下保溫20 min后,加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml,振蕩混勻后在4℃和1.5×103×g下離心 10 min。取上清液2.5 ml,加入2.5 ml蒸餾水和0.5 ml0.1%的FeCl3溶液,靜置10 min后,溶液由黃色變?yōu)樗{色,在700 nm下進行比色。用蒸餾水代替馬齒莧樣品液做空白實驗。本實驗陽性對照品為人工合成抗氧化劑BHT,同法操作,并測定吸光度。每種濃度下平行測定3次。溶液的吸光度越大,表示還原能力越強。

2.6 統(tǒng)計學處理 每個濃度平行測量3次,結果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,采用兩因素析因設計定量資料一元方差分析,對清除率做了平方根反正弦變換。數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果和討論

3.1 清除DPPH自由基 DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,呈紫色,在517 nm下有強吸收。當有自由基清除劑存在時,DPPH自由基與自由基清除劑給出的氫相結合,孤電子被配對,使其顏色由紫色變?yōu)榈S,吸光度減少,反應結束后達到穩(wěn)定[2]。因此,可通過在此波長處吸光度的測定,來檢測自由基的清除情況。結果見表1。與藥物、劑量、藥物與劑量交互作用對應的方差分析結果分別為:F=2 135.26,P＜0.000 1;F=10 897.1,P＜0.000 1;F=797.09,P＜0.000 1。說明兩種藥物之間的差別、5種劑量之間的差別、藥物與劑量的交互作用均有統(tǒng)計學意義。分別在各劑量下比較兩種藥物之間的差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.000 1)。

表1 馬齒莧提取物對DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

表1 馬齒莧提取物對DPPH自由基的清除率Table 1 Scavenging DPPH free radical activities of extract of Portulaca oleracea

DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼

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3.2 清除羥基自由基 羥基自由基最活潑,其反應速率極快,可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子,尤其對脂質(zhì)的過氧化作用更強[3]。在低濃度時維生素C清除羥基自由基能力較強,但在濃度達到2.50 mg/ml后趨于穩(wěn)定,清除活性不再顯著增加,而馬齒莧提取物的清除活性與濃度呈正相關,在高濃度時清除活性明顯優(yōu)于維生素C,結果見表2。方差分析結果與清除DPPH自由基結果基本相同。

3.3 清除超氧陰離子自由基 超氧陰離子自由基不僅具有重要的生物功能,也與多種疾病有密切關系。它是基態(tài)氧接受一個電子后形成的第一個氧自由基,可經(jīng)過一系列反應生成其他的氧自由基[4]。表2結果顯示,維生素C在低濃度時,清除超氧陰離子自由基的能力顯著優(yōu)于馬齒莧提取物,隨著濃度的升高,馬齒莧清除超氧陰離子自由基活性不斷增強,效果逐漸優(yōu)于維生素C。方差分析結果與清除DPPH自由基結果基本相同。

表2 馬齒莧提取物對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

表2 馬齒莧提取物對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 2 Clearing rates of hydroxyl free radical and superoxide negative ion free radical by extract of Portulaca oleracea

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3.4 還原能力測定結果 抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的,還原力越弱,抗氧化性越強。因此,可通過測定還原力來說明抗氧化活性的大小。圖 1的結果顯示,在濃度0～200 μ g/ml范圍內(nèi),馬齒莧提取物的還原能力弱于對照藥BHT,即抗氧化力強于BH T。

圖1 馬齒莧提取物的還原能力Figure 1 Reducing ability of extract of Portulacaoleracea

馬齒莧在我國有悠久的食用歷史,是最常見的中草藥和野生蔬菜,藥理作用廣泛,它營養(yǎng)豐富,且來源廣泛,有較強的經(jīng)濟藥用價值。本研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧具有較強的清除自由基能力。馬齒莧的種植及其制品的開發(fā)具有廣闊的前景。但是馬齒莧的應用仍然存在一些問題,首先其成分復雜,不能從分子水平上明確發(fā)揮藥性的有效成分;第二,我國馬齒莧資源雖然豐富,但多為野生,少有栽培,其利用率非常低。這些問題有待于科研人員進一步的研究和探索。

[1] 賀圣文,賀圣光,趙仁宏,等.野生馬齒莧對家兔機體血脂及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].中國公共衛(wèi)生,1997,13(3):157-158.He ShengWen,He ShengGuang,Zhao RenHong,et al.Effects of wild Portulaca oleracea on blood lipid and lipid peroxidation in rabbits[J].J Chin Pub Health,1997,13(3):157-158.Chinese.

[2] Moon J W,馬玉林,李冬鳴.唐古特大黃和綠茶不同溶劑提取物對DPPH自由基清除作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(26):14310-14311.Moon J W,M a YuLin,Li DongMing.Study on DPPH free radical scavenging activities of extracts from Rheum tanguticum and green tea[J].J Anhui Agri Sci,2010,38(26):14310-14311.Chinese with abstract in English.

[3] 秦德安,蘇 丹,王曉玲.橙皮苷對羥自由基的消除作用[J].中國藥學雜志,1996,31(7):396-398.Qin DeAn,Su Dan,Wang XiaoLing.Scavenging action to hydroxyl free radical of hesperidin[J].Chin Pharm J,1996,31(7):396-398.Chinese with abstract in English.

[4] Poon H F,Calabrese V,Scapagnini G,et al.Free radicals:key to brain aging and heme oxy genase as a cellular response to oxidative stress.[J].J Gerontol Med Sci,2004,59A(5):478-493.