張波 ，李軍立，李玉鋒 *，何洋， 劉震東， 謝紫瑩

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075；3.成都國嘉制藥，四川 成都610036）

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）為百合科藥用植物，其干燥鱗莖，有清熱潤肺、化痰止咳的功效，主治肺熱燥咳、咯痰帶血、痰多胸悶等癥[1]。由于暗紫貝母生長環(huán)境特殊，喜寒涼氣候，野生分布于海拔3200～4500m的高山高原草地上，低于海拔3000m就不能生長，很難人工引種栽培，加之其生長周期長，產(chǎn)量很少.，因此價(jià)格昂貴，且過度依賴于野生資源[2-4]。暗紫貝母鱗莖離體培養(yǎng)，有利于野生暗紫貝母的資源保護(hù)和開辟藥材資源新途徑，實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）由四川省國嘉制藥新荷花藥材種植基地提供并鑒定。其他常見試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無菌材料的獲得 取暗紫貝母鮮鱗莖，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干，然后用70%的乙醇浸泡1min，滅菌濾紙吸干，最后用0.1%的HgCl2浸泡消毒10min，無菌水沖洗5次，滅菌濾紙吸干。鱗莖切成約0.5cm的塊[1,2,5]。

1.2.2 外植體接入不同濃度配比的培養(yǎng)基 在無菌操作條件下，將上述塊狀鱗莖接種到pH5.8，蔗糖3%，VC0.1 g/L，附加 NAA+6-BA不同配比濃度的MS培養(yǎng)基上[1,6]。

1.2.3 培養(yǎng)方法 在0℃無菌條件下，培養(yǎng)48h后[4,6-8]，再在溫度：20℃，光照強(qiáng)度：1000-1500Lx，每天光照時(shí)間：16h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)[1,2]。

1.2.4 計(jì)算方法 培養(yǎng)50天后取材，統(tǒng)計(jì)接種外植體的數(shù)量，誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)量、不定芽的數(shù)量，并計(jì)算其愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率[9-10]，最終確定誘導(dǎo)暗紫貝母愈傷組織和不定芽的NAA和6-BA的最佳配比濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鱗莖外植體接種到培養(yǎng)基上20d之后開始逐漸生長，一部分鱗莖體積逐漸增大，其切口處外部有透明淡黃綠色的小顆粒狀突起出現(xiàn)和（或）小的新芽生成，并且其誘導(dǎo)出的愈傷組織和不定芽體積逐漸增大，30d左右能夠清晰地看到半透明狀的質(zhì)地疏松的愈傷組織和白色的不定芽，50d后愈傷組織和不定芽生長逐漸穩(wěn)定（見圖1）。培養(yǎng)50d后，將采集到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)制成表1和表2。

表1 不同配比濃度NAA+6-BA誘導(dǎo)的鱗莖外植體愈傷組織數(shù)量

表2 不同配比濃度NAA+6-BA誘導(dǎo)的鱗莖外植體不定芽數(shù)量

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對實(shí)驗(yàn)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表3、4。

表3 鱗莖外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率（%）

從表3可知，不同濃度的激素組合會(huì)對鱗莖外植體愈傷組織的形成有一定影響，且其影響差異較為顯著。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L配比濃度的培養(yǎng)基上鱗莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率為53.3%，明顯高于其它濃度配比下的誘導(dǎo)率，比第二高誘導(dǎo)率高60%。

表4 鱗莖外植體不定芽的誘導(dǎo)率（%）

從表4可知，不同濃度的激素組合會(huì)對鱗莖新生芽的形成有一定的影響，且其影響差異較為明顯。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.6 mg/L配比濃度的培養(yǎng)基上的鱗莖新芽生成率為73.3%，明顯高于其它濃度配比下的生成率，比第二高生成率高22.2%。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道貝母鱗莖再生途徑主要有三條：1、外植體先經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，再由愈傷組織分化發(fā)育形成不定芽，最后由不定芽形成新的小鱗莖；2、愈傷組織表層和內(nèi)層一些特化了的胚性細(xì)胞經(jīng)多次分裂發(fā)育形成胚狀體，進(jìn)而再由胚狀體形成小鱗莖；3、外植體表面直接生長出小芽或鱗莖，適用于暗紫貝母培育，且培育時(shí)間相對較短[3]。本實(shí)驗(yàn)即采用第三條培養(yǎng)途徑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)時(shí)間相對較短，且直接培養(yǎng)可避免再次培養(yǎng)引起的霉變。由于本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件中光照時(shí)間為16h/d，所以誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目多于愈傷組織，且不定芽的色澤為白色，而愈傷組織呈蛋黃綠色，為質(zhì)地疏松的半固態(tài)狀。

本實(shí)驗(yàn)借鑒低溫誘導(dǎo)對組培川貝母胚狀體成苗的影響[8]和紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)[6]中防褐變措施，采用外植體接種后先經(jīng)低溫處理48h再進(jìn)行培養(yǎng)的方法，此法可有效地抑制外植體內(nèi)在多酚氧化酶（PPO）引起的褐變[11]。一般PPO最適溫度為20-35℃，低溫前處理可有效地抑制外植體在培育初期極易產(chǎn)生的褐變，同時(shí)低溫也在一定程度上抑制了霉變的發(fā)生。添加了0.1g/L的cV也能在一定程度上抑制了褐變的發(fā)生[6]，但對于暗紫貝母的適用量仍需要在今后的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證和討論。PPO的最適pH值在6.0—7.4范圍，大多在7.0-7.4范圍[11]，而組織培養(yǎng)要求培養(yǎng)基的pH為5.8，因此應(yīng)嚴(yán)格調(diào)試培養(yǎng)基的pH，也能從根本上抑制PPO的活性。

實(shí)驗(yàn)表明不同濃度NAA+6-BA配比對暗紫貝母鱗莖外植體新芽的生成和愈傷組織的形成有一定的影響。在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下，NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比誘導(dǎo)形成的愈傷組織較多；NAA1.2mg/L +6-BA1.6mg/L濃度配比誘導(dǎo)生成的新芽較多；NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比條件下生成的新芽和愈傷組織均較多。綜合分析，NAA1.2mg/L為鱗莖誘導(dǎo)的適宜濃度，而愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)對6-BA濃度反應(yīng)則不同，但都為適中濃度，過高或過低的濃度的NAA +6-BA組合都不適宜鱗莖的誘導(dǎo)。

通過對暗紫貝母愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的研究，可以進(jìn)一步優(yōu)化和建立川貝母培養(yǎng)體系，解決野生貝母資源緊缺的問題，為天然藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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