鄒盛勤

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000）

虎杖( polygonum cuspidatum siobet Zucc.) 為蓼科屬多年生草本植物的根或根莖，在我國大部分地區(qū)廣泛分布?；⒄刃晕段⒑⒖?，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對虎杖的化學(xué)成分、藥理作用、提取分離做了許多研究，發(fā)現(xiàn)其根莖含有多羥基芪類化合物白藜蘆醇及其苷，屬于單寧質(zhì)多酚[1]，對人體具有降血脂、抗血栓、預(yù)防動脈硬化、增強(qiáng)免疫功能等重要調(diào)節(jié)作用，是一種極具開發(fā)價值的天然物質(zhì)[2]。據(jù)調(diào)查，目前市場上的藥材主要來源于江西、貴州、四川、江蘇、浙江等地區(qū)，主要含有蒽醌類化合物、白藜蘆醇及苷、水溶性多糖和鞣質(zhì)等成分，在臨床上廣泛應(yīng)用[3,4]。本文建立了同時測定不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇的定量方法，為客觀評價虎杖的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器和試藥

Waters HPLC儀(美國，515泵，2996光電二極管陣列檢測器，77251進(jìn)樣閥，Empower中文色譜數(shù)據(jù)工作站)；SK2510HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司) ；RO-MB-10D高純水機(jī)(杭州永潔達(dá)膜分離設(shè)備廠)。甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），其余試劑均為分析純，水為超純水。虎杖苷、白藜蘆醇對照品（Sigma公司）?；⒄雀勺越魇∫舜菏校?jīng)鑒定為蓼科植物虎杖polygonum cuspidatum的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取虎杖苷和白藜蘆醇3.58 mg和3.70 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得含虎杖苷和白藜蘆醇0.358 mg/mL和0.370 mg/mL的對照品混合溶液，備用。

2.2 樣品溶液的制備

虎杖根與80℃下烘干8 h，粉碎過20目篩。精密稱取2.0 g虎杖根粉末于50mL容量瓶中，加入50 ml甲醇，稱重。超聲提取30 min，冷卻后補(bǔ)足損失重量，搖勻后用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3 檢測波長的選擇

采用PAD檢測器在190~400 nm波長范圍內(nèi)掃描，虎杖苷在流動相中的最大吸收波長均為216.3和319.2 nm，白藜蘆醇在流動相中的最大吸收波長為216.3 和306.1 nm選擇319 nm為檢測波長，信噪比高，基線平穩(wěn)，待測組分峰形對稱?；⒄溶蘸桶邹继J醇在流動相中的紫外吸收光譜見圖1

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流動相為甲醇∶1%磷酸水溶液（50∶50），流速為0.8 mL/min，檢測波長319 nm，柱溫30℃，采用外標(biāo)法定量分析。虎杖苷和白藜蘆醇理論塔板數(shù)均大于3000，對稱因子分別為1.03、1.05。對照品及樣品色譜圖見圖2。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取對照品混合溶液10 μL，平行進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算色譜系統(tǒng)精密度，虎杖苷和白藜蘆醇峰面積RSD分別為0.42 %(n=5)和0.56 %(n=5)。進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對照品溶液分別于1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積?；⒄溶蘸桶邹继J醇峰面積的RSD分別為0.84%和1.14%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一虎杖根樣品5份，每份各約2.0 g，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，測定其峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算含量，虎杖苷和白藜蘆醇含量的RSD分別為1.95 %(n=5)和1.62 %（n=5）。結(jié)果表明，樣品制備方法重現(xiàn)性良好。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品混合溶液各2.0，6.0，10.0，15.0，20.0 mL進(jìn)樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(μV·s)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得虎杖苷回歸方程為：Y=3.02×105X-1.84×104（r=0.9996），線性范圍0.716~7.160 μg，LOD（檢測限）為0.92 ng，LOQ（定量限）為2.61 ng；白藜蘆醇回歸方程為：Y=3.40×105X-2.16×104（r=0.9998），線性范圍0.740~7.400 μg，LOD為0.85 ng，LOQ為2.17 ng。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的虎杖根樣品6份，每份約1.0 g，分別加入虎杖苷和白藜蘆醇對照品適量，按樣品制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測定含量，虎杖苷平均回收率為99.7 %，RSD為1.81 %（n=6）；白藜蘆醇平均回收率為98.5 %，RSD為2.02 %（n=6）。

2.9 樣品含量測定

取不同根齡虎杖根藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，準(zhǔn)確吸取20μL，進(jìn)樣分析，平行測定3次，外標(biāo)法計(jì)算各樣品中虎杖苷和白藜蘆醇的含量。樣品測定結(jié)果見表1。

表1 不同根齡虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 測定結(jié)果表明，不同根齡虎杖根樣品中白藜蘆醇及其苷的含量差異較大，虎杖苷和白藜蘆醇在根齡2~3年間含量均最高，虎杖苷的含量約為白藜蘆醇的4倍。提示虎杖根的最佳采收期為根齡2~3年，期間其主要活性物質(zhì)芪類化合物及其苷總含量最高。

3.2 在樣品預(yù)處理時，保持其他提取條件不變，考察了提取次數(shù)對樣品中虎杖苷和白藜蘆醇提取率的影響。經(jīng)測定比較，第2次提取液中虎杖苷的峰面積為第1 次提取液的2.46 %，白藜蘆醇的峰面積為第1次提取液的2.22%，可認(rèn)為提取1 次后，虎杖根中虎杖苷和白藜蘆醇已基本提取完全。故樣品溶液的制備均采用甲醇超聲提取30 min。

3.3 本文建立了同時測定不同根齡虎杖根中的2種主要有效成分含量的反相高效液相色譜定量方法，虎杖苷和白藜蘆醇獲得基線分離，且具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于虎杖藥材的質(zhì)量控制。

[1] 潘明新,王小陽.虎杖的化學(xué)成分及其藥理作用[J].中藥材,2000,23(1):56-58.

[2] 肖凱,宣利江,徐亞明,等.虎杖的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志, 2003, 38(1): 12-15.

[3] 黃遠(yuǎn)芬,李蓓蓓,羅霄山.虎杖及其有效成分藥理作用研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué), 2000,10(6): 13-15.

[4] 楊紅美,陳波,曾建國,等.HPLC同時測定虎杖及其提取物中4種有效成分的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(3):202-205.