閆麗雋, 趙 欣, 邵淑麗 (山西省腫瘤醫(yī)院婦科, 太原 030013;通訊作者,E-mail:YLJ7576@sina.com)
子宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國家尤為常見,是婦科三大惡性腫瘤之一,其死亡率占中國女性癌癥的第2位[1,2]。在子宮頸癌的組織學(xué)分型中鱗狀細(xì)胞癌(包括角化型43.3%,非角化型 29.1%,小細(xì)胞型 10.9%)就占83.3%。鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關(guān)抗原,其血清學(xué)檢測已被廣泛用于臨床子宮頸癌的輔助診斷,且具有器官特異性較高和良性疾患特異性較低的特點,但值得注意的是在體外收集標(biāo)本和測量過程中存在影響因素,如皮膚污染和涎液可能強烈影響SCC-Ag的水平,在患一些良性疾病如肺結(jié)核、支氣管囊腫、皮膚濕疹、牛皮癬等時,SCC-Ag也可以升高。Buyru等[3]發(fā)現(xiàn)檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率,我們用TaqMan探針real-time-PCR方法檢測子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SCCA1 mRNA和SCCA2 mRNA的表達(dá)并探討其臨床意義。
1.1 病例來源 選擇2006-01~2007-01山西省腫瘤醫(yī)院首診的子宮頸鱗癌患者60例,采用FIGO1985年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分期,其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例(取門診首診患者活檢組織),年齡27-66歲,平均年齡53.93歲。收集手術(shù)切除的子宮頸鱗癌新鮮癌組織標(biāo)本,取30例因子宮肌瘤作全子宮切除的正常子宮頸組織作對照(均經(jīng)病理證實)。
1.2 試劑 Trizol液,氯仿,異丙醇,70%乙醇,DEPC水,M-MLV cDNA Kit(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);瓊脂糖(AgaroseⅡ,加拿大 BBI公司),擴增試劑盒TagMan universal master mix reactions(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA)美國 Taq-Man公司;基因表達(dá)試劑盒(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA)美國TaqMan公司。
1.3 方法
1.3.1 總RNA提取 采用Trizol試劑提取子宮頸組織中總RNA,取1 μl經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。
1.3.2 cDNA合成 應(yīng)用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(上海生工)制備cDNA,以O(shè)ligo-p(dT)為引物,按說明書操作合成cDNA第一鏈。操作步驟:模板RNA 2 μl,Oligo-p(dT)引物 1 μl,RNase-free H2O,定容至12 μl,70 ℃ 5 s。再加入 5 × 反應(yīng)液 4 μl,RNase 滅活酶 1 μl,dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl,37 ℃ 5 s。加M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl 37℃ 60 s,70℃ 10 s終體積為 20 μl,結(jié)束反應(yīng),加 RNase-free H2O 至 200 μl,-80℃冷凍保存。
1.3.3 RT-PCR 在 ABI Prism 7000(ABI公司,美國)實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行實時定量擴增,總反應(yīng)體系為 25 μl,含 TaqMan 總反應(yīng)體系 12.5 μl,上游和下游引物各 1.25 μl,TaqMan Probe RNasefree H2O 6.25 μl,cDNA 5 μl。反應(yīng)條件為:2 min 50℃,95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 min,60 ℃ 1 min,共50 個循環(huán),所有測定為雙管重復(fù),以GAPDH為內(nèi)參照基因。引物設(shè)計見表1。
表1 引物序列Tab 1 Primer sequence
1.4 結(jié)果判定 在每次實驗中系統(tǒng)濃度稀釋被用來測定擴增效率。SCCA1和 SCCA2基因相對于GAPDH的相對表達(dá)計算如下:相對表達(dá)率用公式△Ct=Ct目的基因- Ct內(nèi)參照基因,表示其表達(dá)的相對拷貝數(shù),△Ct值越低,實際拷貝數(shù)越高。
2.1 SCCA1和SCCA2 mRNA在子宮頸癌的表達(dá)SCCA2 mRNA在子宮頸鱗癌組織與正常子宮頸組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。SCCA2 mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)較正常子宮頸組織中△Ct值低,其實際含量則高。而SCCA1 mRNA在兩種組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。
在癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)高于SCCA1 mRNA,經(jīng)配對t檢驗分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-11.347,P <0.001)。
表2 SCCA1和SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)Tab 2 Expression of SCCA1 and SCCA2 mRNA in tissues of cervical squamous cell carcinoma and normal cervix
2.2 子宮頸癌組織中SCCA mRNA表達(dá)與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)較無淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.853,P<0.01),而SCCA1 mRNA的表達(dá)則無統(tǒng)計學(xué)差異。
不同年齡及不同病理分級中SCCA2 mRNA及SCCA1 mRNA的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
經(jīng)單因素方差分析,不同臨床分期的患者癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.313,P=0.002),經(jīng) LSD 法兩兩比較,三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,然后進(jìn)行Sperman秩相關(guān)分析,結(jié)果顯示 r= -0.616,P <0.001,說明隨著臨床分期的增高,SCCA2 mRNA的表達(dá)增高。而SCCA1 mRNA在不同臨床分期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.734,P=0.083)。
表3 SCCA mRNA表達(dá)與年齡、淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級、臨床分期的關(guān)系Tab 3 Correlation of expression of SCCA mRNA with age,lymph node metastases,histological grade and FIGO stages
鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關(guān)抗原,血清學(xué)檢測已廣泛被用于臨床子宮頸鱗癌輔助診斷,鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一個成員,存在于子宮頸、子宮、頭頸等鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,特別是在非角化大細(xì)胞中含量豐富。但單獨測定SCC-Ag不能作為子宮頸鱗癌的診斷依據(jù)。Bugru等[3]發(fā)現(xiàn)檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率。SCCA就其生物學(xué)活性來說屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員,目前產(chǎn)生SCCA的兩種形式的基因SCCA1和SCCA2已被鑒別,其定位在常染色體 18q21.3 中大約 500 kb 的區(qū)域[4,5],SCCA1和SCCA2在核苷酸水平上有98%的同源性,在氨基酸水平上有92%的同源性[6],兩種基因分別編碼SCCA的兩種形式,SCCA1編碼中性形成的蛋白,SCCA2編碼酸性形成的蛋白。Barnes等[7]研究發(fā)現(xiàn),SCCA2在宮頸鱗癌中的表達(dá)明顯增高,他認(rèn)為此基因是更重要的腫瘤標(biāo)記物。
在組織中檢測mRNA水平的SCCA1和2是困難的,因為兩者在核苷酸水平上有高度的同源性,Takeda等[8]發(fā)現(xiàn)用 RT-PCR可以區(qū)別組織中 SCCA1和SCCA2 mRNA的表達(dá),同時Zen等[9]測定口腔鱗癌患者外周血中的SCCA mRNA和表皮生長因子mRNA,使用一般RT-PCR只能在少數(shù)病例中測到,而使用TaqMan RT-PCR時大約50%病例中有表達(dá)。本研究采用TaqMan探針實時熒光定量法分析60例子宮頸鱗癌組織及30例正常子宮頸組織中SCCA1和SCCA2 mRNA的表達(dá),結(jié)果表明,SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織表達(dá)明顯高于正常宮頸組織,而SCCA1 mRNA在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),Murakami等[10]研究發(fā)現(xiàn) SCCA2 mRNA 的拷貝數(shù)在惡性組織中比正常組織中高,而SCCA1則沒有明顯的不同。這與本試驗的研究結(jié)果相符。并且Murakami等還認(rèn)為有效地定量SCCA2 mRNA在鱗癌患者診斷和治療過程中是非常有意義的。因為SCCA2調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲病毒感染相關(guān)抗原E鈣蛋白的表達(dá),而E鈣黏蛋白是一個與子宮頸鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)的預(yù)后因素[11],因此他們認(rèn)為SCCA2可能與癌的侵襲和轉(zhuǎn)移行為有關(guān)。Nawata等[12]認(rèn)為過度表達(dá)的SCCA2基因可能在腫瘤細(xì)胞的共性行為中扮演重要角色。
SCCA2 mRNA的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系:腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展的兩個關(guān)鍵步驟,也是影響預(yù)后的重要因素,腫瘤的轉(zhuǎn)移是個高選擇、多步驟、多因素參與腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)過程。子宮頸癌以直接侵犯鄰近組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主,血行轉(zhuǎn)移極少,影響子宮頸癌預(yù)后的臨床病理因素很多,其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是顯著的獨立預(yù)后因素。文獻(xiàn)報道,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者5年生存率為82.2%,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 5年生存率則為50.8%[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 SCCA2 mRNA的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高(t=2.853,P<0.01),SCCA1 mRNA表達(dá)則無此特點。由于腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移都需要細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解,推斷SCCA2能夠改變鱗癌細(xì)胞的侵襲表型,可能是通過刺激MMP-9蛋白的產(chǎn)生,而明膠酶MMP-9能分解基質(zhì)膜中的巢蛋白,在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。另外,試管內(nèi)侵襲分析發(fā)現(xiàn)SCCA1和SCCA2能顯著助長細(xì)胞的侵襲能力。本實驗僅發(fā)現(xiàn)SCCA2有此特點,因此還需大樣本實驗進(jìn)一步證實。
SCCA2 mRNA的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系:近年來臨床上提出了“腫瘤分子分期”的觀點,即將分子生物學(xué)的理論和技術(shù)與腫瘤的臨床分期有機地結(jié)合起來,來診斷那些常規(guī)檢查方法不能診斷的存在于全身各系統(tǒng)中的亞臨床轉(zhuǎn)移,使腫瘤的分期更加準(zhǔn)確,以指導(dǎo)臨床治療方案的確定。本實驗結(jié)果顯示隨臨床分期的增高,子宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)有增高趨勢(r= -0.616,P <0.001),SCCA2 mRNA的檢測有助于準(zhǔn)確分期,從而更加有針對性制定個性化的治療方案,為改善預(yù)后提供可能。
SCCA1和SCCA2 mRNA在鱗狀上皮層呈特異性地表達(dá),應(yīng)用TaqMan探針real-time-PCR方法可以定量檢測mRNA的水平,能夠較直觀反映宮頸癌組織中SCCA的表達(dá)水平,為SCCA在宮頸癌的早期診斷、臨床分期及預(yù)后提供一定的理論依據(jù),但關(guān)于SCCA1和SCCA2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的各自及相互作用機制還需要深入研究。
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