蔣愛鳳,胡喜巧,李蘭

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

中性蛋白酶作用條件溫和,是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑[1],可應(yīng)用于食品、制藥、化妝品以及絲紡等行業(yè)[2].其中,在食品中可用于餅干、面包、面條的生產(chǎn)與加工、酒類發(fā)酵、啤酒、果汁飲料澄清、醬油的釀制等,也可用來水解各種蛋白質(zhì)以獲得多肽或氨基酸.中性蛋白酶生產(chǎn)既可以從動植物組織中提取,也可以通過微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn),將植物作為蛋白酶的來源會受到一些諸如氣候條件,以及可利用土地面積的大小等因素的影響,并且從植物中提取蛋白酶是一個極其耗時的過程,而以動物作為蛋白酶的來源,其產(chǎn)量的大小主要依賴于可被屠宰牲畜的數(shù)量.由于從植物和動物中生產(chǎn)蛋白酶具有局限性,人們越來越多地把目光投到微生物蛋白酶上,微生物由于生長速度快、所需空間狹小、廣泛的生化多樣性及其遺傳可操作性等特點(diǎn),因而備受人們青睞.據(jù)統(tǒng)計,微生物蛋白酶占據(jù)了世界整個酶銷售市場約40%的份額,已成為市場上蛋白酶生產(chǎn)的主要來源.

米曲霉Aspergillus oryzae是美國食品藥物管理局（FDA）公布的40余種安全微生物菌種之一[3],米曲霉的酶包括蛋白酶、淀粉酶、肽酶、谷氨酰氨酶、脂肪酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶、纖維素酶及麥芽糖酶等酸、中、堿性酶,其中起關(guān)鍵作用的是蛋白酶.張淑娟[4]、Padmanabhan[5]、Fushimi[6]等對米曲霉中性蛋白酶部分特性進(jìn)行了研究,但仍未見系統(tǒng)的研究文獻(xiàn),尤其是在酶的提取方法方面.

從釀造白酒的大曲中分離純化得到米曲霉菌種,系統(tǒng)地研究了該酶的提取方法以及溫度、鹽度、pH、乙二胺四乙酸（EDTA）等對米曲霉中性蛋白酶活力的影響,并研究得出該酶的米氏常數(shù)Km及其最大反應(yīng)速率Vmax,以期能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)提供理論參考依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

米曲霉：河南某白酒廠白酒大曲中分離純化得到.培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基[7].

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑 除酪蛋白（浙江富陽杭富生物制品廠）為生化試劑外,其他藥品均為分析純試劑.麥麩、黃豆粉為市購.

1.2.2 儀器 YXQG02型手提式滅菌鍋（山東安得醫(yī)療科技有限公司）,BCM-1000型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）,HH-SYZ1-NI型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）,722型分光光度計（上海第三分析儀器廠）.

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 米曲霉菌種分離 將白酒大曲研磨成粉狀,制成菌懸液,并對其進(jìn)行梯度稀釋,并涂布平板,30℃培養(yǎng)5 d,根據(jù)菌落的生物學(xué)特征,篩選出目的菌株米曲霉.將米曲霉挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)5 d,斜面長好后放入冰箱保存待用.

1.3.2 固體培養(yǎng) 在無菌超凈工作臺中接3環(huán)斜面菌種于三角瓶麩皮豆粕固體培養(yǎng)基中,充分搖勻.于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并分別于24 h和48 h各扣瓶,共培養(yǎng)72 h.

1.4 分析方法

1.4.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取試管編號按照表1配置各種不同濃度的酪氨酸溶液,后分別吸取不同濃度的酪氨酸1mL于相應(yīng)試管中,再各加入0.4mol的Na2CO3溶液5mL,加入已稀釋3倍的Folin-酚試劑1mL.搖勻后置于水浴鍋中,40℃保溫反應(yīng)20min,用722型分光光度計在660 nm下進(jìn)行測定.試驗(yàn)做3次重復(fù),用蒸餾水做空白對照.所測得的光密度為凈OD值.以凈OD值為橫坐標(biāo),酪氨酸的濃度為縱坐標(biāo),繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 配制各種不同濃度的酪氨酸溶液試劑

1.4.2 中性蛋白酶活力測定：Folin-酚法[8]

1.4.3 粗酶液的制備 將發(fā)酵好的培養(yǎng)物于40℃恒溫箱中烘干,并用研缽研磨成細(xì)粉.稱取固體樣品各5 g于3個燒杯中,然后分別向3個燒杯中各加入100mL生理鹽水、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液、蒸餾水.分別用玻璃棒攪拌均勻,置30℃恒溫水浴鍋中浸取30min,每10min攪動1次,用低速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速為4000 r/min）離心20min取上清,即為粗酶液[9]。

1.4.4 粗酶的硫酸銨沉淀提取 設(shè)置不同濃度梯度的硫酸銨溶液,對所分離的粗酶液進(jìn)行作用,通過測定酶活力來確定硫酸銨沉降中性蛋白酶的濃度[10].

1.4.5 酶學(xué)性質(zhì)研究 設(shè)置不同的溫度梯度、作用時間梯度、pH梯度、氯化鈉濃度梯度、EDTA濃度梯度對粗酶液進(jìn)行反應(yīng),通過測定酶活力,對酶的最適作用溫度、酶的熱穩(wěn)定性、最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性、中性蛋白酶的耐鹽性、EDTA對酶活性的影響進(jìn)行研究.并對蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）進(jìn)行確定.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對酶活力的影響

將用3種不同溶液提取方法得到的粗酶液,再用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋,稀釋倍數(shù)為0、2、4、6倍,每個稀釋倍數(shù)做3次重復(fù),分別測酶活力,以確定該中性蛋白酶的最佳提取方法.結(jié)果見表2.

表2 不同提取方法測得的單位酶活力

從表2可見,在3種提取方法及各個稀釋倍數(shù)中,用生理鹽水提取測得的單位酶活力值最大,故效果最好,pH7.2緩沖溶液提取效果次之,蒸餾水提取的效果最差.本試驗(yàn)也說明了稀釋2倍時提取效果較穩(wěn)定.故選擇用生理鹽水并稀釋2倍作為制取粗酶液的方法.

2.2 硫酸銨沉淀蛋白酶最適濃度的選擇

取25mL刻度試管分別稱入0、1.40 g、2.85 g、4.40 g、6.07 g、7.83 g、9.75 g、11.80 g、14.03 g、16.55 g的硫酸銨用浸提后未稀釋的粗酶液定容至25mL,配制成0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸銨溶液,置于4℃冰箱中過夜.4000 r/min離心10min去除固形物.分別取上清液測定各個試管中殘余中性蛋白酶酶活力,以確定硫酸銨沉降中性蛋白酶的濃度.以未加硫酸銨處理的酶活力為100%作為對照,計算相對酶活力.以硫酸銨濃度為橫坐標(biāo),以相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖2.

從圖2可以看出,粗酶液中殘余的中性蛋白酶相對酶活力隨著硫酸銨飽和度的提高而減小,故隨著硫酸銨濃度的增加,中性蛋白酶的提取效果越好.由圖顯示：沉淀中性蛋白酶的硫酸銨濃度應(yīng)為80%.

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶的最適作用溫度及酶的熱穩(wěn)定性

圖2 硫酸銨濃度對蛋白酶沉淀的影響

2.3.1.1 酶的最適作用溫度 將用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋好的粗酶液分別在35℃、40℃、45℃、50℃ 、55℃ 、60℃ 、65℃ 、70℃的條件下與1%酪素底物反應(yīng)10min,其余條件相同,測定中性蛋白酶酶活力.以55℃處理下的酶活力為100%作為對照,計算相對酶活力.以相對酶活力為縱坐標(biāo),酶的作用溫度為橫坐標(biāo)作圖3.

從圖3可以看出：55℃時相對酶活力達(dá)到最大,60℃酶活力開始下降.因此,米曲霉中產(chǎn)中性蛋白酶作用的最適溫度為55℃.2.3.1.2酶的熱穩(wěn)定性 取用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋好的粗酶液于40℃、50℃、60℃恒溫條件下分別保溫 0min、20min、40min、60min、80min、100min 后立即冰浴,根據(jù) Folin- 酚法,測定中性蛋白酶酶活力.以處理時間為0min的酶活力為100%作為對照,計算相對酶活力.以相對酶活力為縱坐標(biāo),酶作用時間為橫坐標(biāo)作圖4.

圖3 酶的最適作用溫度

圖4 酶的熱穩(wěn)定性

從圖4可以看出,40℃的酶活力相對穩(wěn)定,處理80min時,相對酶活力仍保持了62.15%,但當(dāng)處理到100min時,酶活力迅速下降,說明在保溫80min以后,酶蛋白開始迅速變性.50℃下處理60min只保持了相對酶活力的41.5%,處理到80min時,粗酶中幾乎檢測不到酶活力,60℃下處理20min時相對酶活力只有3.62%.這說明該中性蛋白酶不耐高溫處理.

2.3.2 酶的最適作用pH值及酶的pH值穩(wěn)定性將酶液分別用 pH 值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L磷酸緩沖溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后用相應(yīng)pH緩沖溶液配置干酪素,根據(jù)Folin-酚法,測定中性蛋白酶酶的活力.以pH為7.0的酶活力為100%,計算相對酶活力.以相對酶活力為縱坐標(biāo),pH為橫坐標(biāo)作圖5.

圖5 pH對酶活力的影響

由圖5的結(jié)果,可以看出：在pH為7.0時相對酶活力達(dá)到最大.酶的pH穩(wěn)定性反應(yīng)了酶的耐酸堿能力.從圖 5 可知,在 pH 6.0～8.0 范圍,該中性蛋白酶穩(wěn)定性較好,特別在中性偏酸范圍該酶可以保持85.56%以上的相對酶活力.

2.3.3 中性蛋白酶的耐鹽性 將酶液用氯化鈉分別調(diào)至濃度為 4%、8%、12%、16%、20%、24%于40℃保溫1 h后,每個濃度做3個重復(fù).根據(jù)Folin-酚法,測定中性蛋白酶活力.以NaCl濃度為0%的酶活力為100%作為對照,計算相對酶活力.以相對酶活力為縱坐標(biāo),以NaCl濃度為橫坐標(biāo),可得圖6.

從圖6可見,NaCl對中性蛋白酶活力有抑制作用,并隨著鹽度的增高,蛋白酶的相對酶活力逐漸下降,但鹽度為24%時,相對酶活力仍有58.82%.所以,我們在食品釀制過程中可以采取分批加入食鹽的方法,以使中性蛋白酶的活性不致下降得過快.

2.3.4 EDTA對酶活性的影響 將浸提好的粗酶液用不同濃度的EDTA稀釋2倍制成粗酶液,EDTA的濃度在分別為0mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L 、1 mmol/L、2 mmol/L 、5 mmol/L和10mmol/L,每一個濃度做3個重復(fù).根據(jù)Folin-酚法,測定中性蛋白酶活力.以不加EDTA的酶活力為100%作為對照,計算相對酶活力.以相對酶活力為縱坐標(biāo),EDTA濃度為橫坐標(biāo),結(jié)果見圖7.

從圖7可以看出,EDTA對酶活力有一定得影響,并隨著EDTA濃度的升高,相對酶活力不斷下降.但EDTA的濃度大于5.0 mmol/L后,其變化引起的相對酶活力下降變小.因此,可以推斷其中性蛋白酶應(yīng)具有2種或2種以上的,且其中一種為金屬蛋白酶.Fushimi[6]等研究也表明米曲霉中性蛋白酶有2種,其中中性蛋白酶Ⅱ?yàn)楹琙n2﹢離子金屬蛋白酶.

2.3.5 米氏常數(shù)的測定 以2%的酪素溶液為母液分別配制 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的系列標(biāo)準(zhǔn)液各10mL.以酪素為底物,在40℃水浴中,測定不同底物濃度下的酶促反應(yīng)速率,以S/V-S作圖8[11].

由圖8可見,該直線方程為y=0.1789x+0.2649,橫軸的截距為-Km,斜率為1/Vmax.故結(jié)果表明以酪素為底物時,Km值1.51mg/mL,最大反應(yīng)速率Vmax=5.59mg/min.

圖6 NaCl濃度對酶活力的影響

圖7 EDTA對酶活力的影響

圖8 以Hanes Woolf法作S/V與S的關(guān)系

3 結(jié)論

（1）米曲霉中性蛋白酶的最佳提取方法為加入生理鹽水（發(fā)酵干曲：生理鹽水＝1：20）,攪拌均勻,置恒溫（30℃）培養(yǎng)箱中提取30min,每10min攪拌1次,最后用4層紗布過濾.

（2）硫酸銨沉降中性蛋白酶的最佳濃度為80%.該中性蛋白酶的最適作用溫度為55℃,最適pH值為7.0,該酶在40℃下的穩(wěn)定性較好,50℃處理80min和60℃下處理20min,幾乎檢測不到酶活力；該中性蛋白酶pH穩(wěn)定范圍為6.0～8.0.

（3）NaCl和EDTA對中性蛋白酶活力具有抑制作用,隨著NaCl和EDTA濃度的增高,蛋白酶的活力都逐漸下降,當(dāng)鹽度為24%時,相對酶活力仍有58.82%；但EDTA的濃度大于5.0mmol/L后,其變化引起的相對酶活力下降變小.因此,可以推斷其中性蛋白酶應(yīng)具有2種或2種以上的,且其中一種為金屬蛋白酶.

（4）動力學(xué)研究表明：以酪素為底物,米氏常數(shù)值為1.51mg/mL,最大反應(yīng)速率Vmax為5.59mg/min.通過以上研究可以得知,中性蛋白酶是一種生物活性物質(zhì),易受氧化劑的抑制及破壞作用,在貯存或使用過程中應(yīng)避免與之接觸.米曲霉所產(chǎn)的中性蛋白酶是一種具有前景的飼用酶制劑,可用于食品的加工；對于白酒釀制行業(yè),具有節(jié)約糧食,出酒率高,機(jī)械化生產(chǎn)周期短等深遠(yuǎn)意義.

[1]肖懷秋,林親錄,李玉珍,等.中性蛋白酶芽孢桿菌BX-4產(chǎn)酶條件及部分酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2005,24（4）：42-46.

[2]活潑.高溫中性蛋白酶及產(chǎn)生菌的初步研究[J].工業(yè)微生物,2003,33（6）：30-34.

[3]姜文俠,史連生,李韜,等.飼用微生態(tài)制劑-益生素[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2000,17（2）：57-59.

[4]張淑娟,田立強(qiáng),王格,等.米曲霉今野菌株所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)的研究[J].中國調(diào)味品,2001（11）：15-17.

[5]Padmanabhan S,Murthy RamanaM V,Lonsane BK.Applied potential of Aspergillus oryzae CFTRI1480 for producing proteinase in high titresby solid state fermentation[J].Microbiology&Biotechnology,1993,40（4）：499-503.

[6]FushimiN,Ee CE,Nakajima T,et al.Aspzincin,a family of metaloendopeptidaseswith a new zinc-bindingmotif.Identification of new zinc-binding sites（His（128）,His（132）,and Asp（164））and three catalytically crucial residues（Glu（129）,Asp（163）,Tyr（106）） of deuterolysin from Aspergillusoryzae bysite-directedmutagenesis[J].The Journal of BiologicalChemistry,1999,274（34）：24195-24201.

[7]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1986.

[8]ZBX 66030-87,蛋白酶活力測定法[S].

[9]張宏福.飼料企業(yè)質(zhì)量管理手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2003：143-144.

[10]楊士得,邱德全.米曲霉中性蛋白酶特性研究[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報,2006,26（4）：22-26.

[11]張樹政.酶制劑工業(yè)（上）[M].北京：科學(xué)出版社,1984：196-198.