第五永長(zhǎng)，李耀輝，蘇露煜

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710061)

腦組織蛋白激酶與蛋白磷酸酯酶之間的平衡失調(diào)是導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化從而形成阿爾茨海默病(AD)病理改變細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纏結(jié)(NFT)的重要途徑之一,本實(shí)驗(yàn)以側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(ICV-STZ)的方法復(fù)制散發(fā)性老年性癡呆(SAD)模型,以燥濕解毒，助脾散精之中藥復(fù)方ZPSJ提取物進(jìn)行干預(yù),觀察ZPSJ復(fù)方對(duì)SAD模型大鼠海馬組織重要的蛋白激酶糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶-2(PP-2A)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠28只，體質(zhì)量(270±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0034642)。所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、ZPSJ治療組，均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(使用許可證:SYXK【陜】2007-2010)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食和飲水(術(shù)前禁食除外),室溫22～26 ℃，濕度為30%～40%。

1.2 藥品與試劑 ZPSJ方：由人參、蒼術(shù)、黃連等藥物組成，提取物由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)：Merck公司；GSK-3β抗體、PP-2A抗體：武漢博士德生物工程公司；多奈哌齊：由中美合資西安海欣制藥有限公司生產(chǎn)，藥物購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥房(產(chǎn)品批號(hào)：091201)。

1.3 ICV-STZ擬AD模型制備 參考Sharma等[1]的方法，所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上，常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜。除假手術(shù)組外，其余動(dòng)物均用微量注射器每側(cè)側(cè)腦室各注射STZ約18 μL(3 mg/kg，注射前將STZ溶于人工腦脊液,濃度為25 mg/mL)。坐標(biāo)參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》[2]：前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開(kāi)1.5 mm，腦表面下3.5 mm。第3天重復(fù)注射，劑量同前。假手術(shù)組以等量人工腦脊液替代STZ。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)21 d進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試后取材。

1.4 腦組織樣品處理 每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行灌注固定：按4.0 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。動(dòng)物麻醉成功后，將其仰臥于平臺(tái)上，伸展固定四肢，剪開(kāi)胸腹充分暴露心臟和肝臟。迅速插導(dǎo)管于左心室至升主動(dòng)脈并固定，同時(shí)剪開(kāi)右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水100 mL至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，更換4%多聚甲醛先快后慢繼續(xù)灌注30 min，然后斷頭，完整取出鼠腦，置固定液中，24 h后行石蠟包埋切片。每只大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)后連續(xù)冠狀切片，放入0.01M PBST的溶液中進(jìn)行免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 GSK-3β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β的表達(dá)情況(±s,n=6)

2.2 PP-2A免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PP-2A的表達(dá)情況(±s,n=6)

3 討論

目前公認(rèn),AD的病理特征主要為大腦局部尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變,細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和細(xì)胞外老年斑(SP)沉積。決定AD認(rèn)知損害癥狀的關(guān)鍵在于細(xì)胞內(nèi)NFT的形成，而腦組織tau蛋白過(guò)度磷酸化是NFT的形成的源頭。在腦內(nèi),tau蛋白磷酸化受到多種因素的調(diào)節(jié),其中蛋白激酶與蛋白磷酸酯酶之間的平衡失調(diào)是導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化的重要途徑[3]。

近年研究認(rèn)為，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是AD腦內(nèi)引起tau蛋白異常過(guò)磷酸化的最主要蛋白激酶，對(duì)tau蛋白的磷酸化起著非常重要的催化作用。而與此過(guò)程相反,蛋白磷酸酯酶催化著tau蛋白的去磷酸化反應(yīng)，tau蛋白的過(guò)度磷酸化可由于蛋白磷酸酯酶活性降低或數(shù)量減少而引起。其中，最引人注目的當(dāng)屬蛋白磷酸酯酶-2中的PP-2A,PP-2A活性的降低可能是導(dǎo)致AD腦內(nèi)tau蛋白以及其他蛋白過(guò)度磷酸化的主要原因。

近年來(lái)，tau蛋白磷酸化作為AD防治的新靶標(biāo)越來(lái)越得到重視，其中中草藥在抑制tau蛋白磷酸化防治AD病理改變方面顯示了令人鼓舞的作用。如人參中Rb1可以通過(guò)CDK5以及JNK/p38途徑減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化[4]等;知母皂苷B也可通過(guò)緩解Aβ對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制，減輕tau蛋白的異常磷酸化[5]。從中藥吳茱萸未成熟果實(shí)中提取的去氫吳茱萸堿(DHED)可通過(guò)抑制GSK-3β活性從而降低tau蛋白的磷酸化[6]。

本實(shí)驗(yàn)從“脾腦相關(guān)”的理論出發(fā)，以具有燥濕解毒，助脾散精作用的中藥復(fù)方ZPSJ提取物為干預(yù)藥物，采用ICV-STZ擬SAD模型進(jìn)行觀察，結(jié)果表明:ICV-STZ模型大鼠腦組織GSK-3β陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元明顯增多，而PP-2A陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元明顯減少，經(jīng)過(guò)ZPSJ復(fù)方治療后，大鼠腦組織GSK-3β表達(dá)明顯減少,PP-2A表達(dá)明顯增加,與之相對(duì)照的西藥多奈哌齊則無(wú)此作用。本結(jié)果提示: ZPSJ復(fù)方可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦組織GSK-3β和PP-2A的表達(dá)及其平衡而影響到tau蛋白的異常過(guò)度磷酸化,推測(cè)上述結(jié)果可能是復(fù)方中多種成分的協(xié)同作用。有關(guān)該方潛在的影響tau過(guò)度磷酸化防治SAD認(rèn)知損害的深層次機(jī)制，有必要進(jìn)一步深入研究。

[1]Tauheed Ishrat,Kehkashan Parveen,Mohd.Moshahid Khan,Gulrana Khuwaja,M.Badruzza-man Khan,Seema Yousuf,Ajmal Ahmad,Pallavi Shrivastav and Fakhrul Islam.Selenium pre-vents cognitive decline and oxidative damage in rat model of streptozotocin-induced experim-ental dementia of Alzheimer’s type[J].Brain Research,2009(1281):117-127.

[2]George Paxinos Charles Waston著,諸葛啟釧譯.The Rat Brain in stereotaxic coordinates(大鼠腦立體定向圖譜)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

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[4]宋錦秋,陳曉春,張靜,等.人參皂苷Rb1通過(guò)JNK-p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的胎鼠皮層神經(jīng)元tau蛋白過(guò)度磷酸化[J].藥學(xué)學(xué)報(bào).2008,43:29-34.

[5]鐘雷,譚潔,歐陽(yáng)石,等.知母皂苷B對(duì)大鼠海馬注射Aβ25～35致tau蛋白磷酸化的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(8):1106-1109.

[6]Peng JH,Zhang CE,Wei W,Hong XP,Pan XP,Wang JZ.Dehydroevodiamine attenuates tau hyperphosphorylation and spatial memory deficit induced by activation of glycogen synthase kinase-3 in rats[J].Neuropharmacology.2007;52:1521-1527.