頓文亮，喻 斌，俞 云

(1.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是慢性肝損傷向肝硬化進(jìn)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵階段，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟的過(guò)度沉積，纖維結(jié)締組織增生。導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，影響血液與肝細(xì)胞的物質(zhì)交換，加重肝細(xì)胞損傷[1]。抗肝纖膠囊具有活血通絡(luò),化瘀散結(jié)功效，臨床主要治療肝纖維化和痰瘀互結(jié)證。本實(shí)驗(yàn)主要觀察抗肝纖膠囊是否具有改善肝纖維化所致慢性血瘀癥血流動(dòng)力學(xué)及凝血功能異常的作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(200～240)g，周齡9～10周，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(浙)2008-0033。

1.2 藥品與試劑 抗肝纖膠囊由三七、老鶴草、五味子等5味中藥組成,采用傳統(tǒng)水煎提取，濃縮至1.4 g(含生藥量)/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前加蒸餾水配制所需濃度；CCL4(分析純)，北京化工廠；鹽酸腎上腺素注射液1 mL∶1 mg，批號(hào)20081210,天津金耀氨基酸有限公司；血漿凝血酶原時(shí)間(PT)試劑盒，批號(hào)(Lot):STG10101-32，北京世帝科學(xué)儀器公司；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒，批號(hào)(Lot):STG20201-24，北京世帝科學(xué)儀器公司；纖維蛋白原(FIB)測(cè)定試劑盒,批號(hào)(Lot):STG20401-22，北京世帝科學(xué)儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀，北京世帝科學(xué)儀器公司;LG-R-80系列血液黏度儀，北京世帝科學(xué)儀器公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 清潔級(jí)大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，室溫(20±2)℃，濕度50%～60%,每天光照10～12 h。

2.2 分組與給藥 隨機(jī)將雄性大鼠分為5組，每組12只，即空白對(duì)照組(全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)、自由飲水)，其他各組模型組、抗肝纖低劑量組1.5 g生藥/kg，抗肝纖中劑量組3.0 g生藥/kg,抗肝纖高劑量6.0 g生藥/kg(每日79.5%單純玉米面加20%豬油、0.5%膽固醇混合飼料飼喂大鼠，另以15%乙醇為飲料飼養(yǎng)動(dòng)物)，抗肝纖各劑量組大鼠給藥容積10 mL/kg，空白對(duì)照組和模型組給等體積生理鹽水。

2.3 造模方法 40% CCL4橄欖油液，皮下注射,首劑0.5 mL/kg,以后0.25 mL/kg,每周2次，持續(xù)8周，每日79.5%單純玉米面加20%豬油、0.5%膽固醇混合飼料飼喂大鼠，另以15%乙醇為飲料飼養(yǎng)動(dòng)物。第7周開始，皮下注射腎上腺素0.1 mg/(kg·d),每天分2次注射，間隔12 h，連續(xù)7 d，造成肝纖化的慢性血瘀癥模型。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟 大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d，于第4天開始抗肝纖各劑量組、模型組開始造模，并灌胃給予相應(yīng)藥物、模型組給予等體積蒸餾水，共持續(xù)8周;空白對(duì)照組給予等量蒸餾水，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)。與第7周開始，皮下注射腎上腺素0.1 mg/(kg·d),每天分2次注射，間隔12 h，連續(xù)7 d。于最后1次皮下注射腎上腺素后，各組大鼠禁食12 h,于次日用10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg腹腔注射)，仰位固定，頸動(dòng)脈插管放血，分別用3.8%的枸櫞酸鈉溶液和肝素鈉生理鹽水溶液(500 U/mL)按1∶9抗凝。

2.5 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo) 1)全血黏度:將肝素鈉抗凝的血液采用LG-R-80系列血液黏度儀測(cè)定。2)血漿黏度：全血測(cè)試完畢后，剩余血樣以3 000 r/min離心,進(jìn)行血漿黏度的測(cè)試。3)凝血功能：將3.8%的枸櫞酸鈉抗凝的血液以3 000 r/min離心10 min，分離血小板血漿，采用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀于37 ℃測(cè)定血小板最大聚集率、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿纖維蛋白原(FIB)。

3 結(jié)果

3.1 抗肝纖膠囊對(duì)慢性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響 見(jiàn)表1。

3.2 抗肝纖膠囊對(duì)慢性血瘀大鼠血小板聚集和凝血功能的影響 見(jiàn)表2。

表1 抗肝纖膠囊對(duì)慢性血瘀癥模型大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(±s,n=8)

表2 抗肝纖膠囊對(duì)慢性血瘀癥模型大鼠血小板聚集和凝血參數(shù)的影響(±s,n=8)

4 討論

肝纖維化屬中醫(yī)“脅痛”“黃疸”“積聚”等范疇，主要病機(jī)為血瘀阻絡(luò)、正氣虛損和濕熱內(nèi)蘊(yùn)。血瘀是肝纖維化形成的基本病機(jī)，也是各種肝病最根本、最重要的病理改變[2]。本實(shí)驗(yàn)參考四氯化碳、高脂、乙醇等復(fù)合因素造成大鼠肝纖維化模型和腎上腺素復(fù)制大鼠血瘀癥模型文獻(xiàn)[3-7]，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獨(dú)創(chuàng)地復(fù)制出大鼠肝纖維化的慢性血瘀癥模型，較以往用腎上腺素造成的血瘀模型更符合肝纖維化所表現(xiàn)的血液高凝狀態(tài)；比四氯化碳等造成肝纖化的血瘀模型更穩(wěn)定。以往的研究[6]發(fā)現(xiàn)，肝血瘀阻與肝纖維化密切相關(guān)，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增生導(dǎo)致：小葉中心的纖維化阻礙血流進(jìn)入肝靜脈，使肝功能損害及循環(huán)障礙；纖維隔的血管交通支使進(jìn)出肝臟的血供相交通,導(dǎo)致門脈高壓和微循環(huán)紊亂[9];T細(xì)胞、枯否細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，釋放相關(guān)細(xì)胞因子，引起機(jī)體凝血-纖溶系統(tǒng)異常和血小板功能紊亂[10]；以及通過(guò)眾多環(huán)節(jié)引起的血液循環(huán)障礙。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抗肝纖膠囊能顯著改善四氯化碳所致的肝功能異常；本實(shí)驗(yàn)顯示了抗肝纖膠囊顯著改善肝纖維化的慢性血瘀癥的血流動(dòng)力學(xué)和凝血功能異常。中藥復(fù)方抗肝纖膠囊可通過(guò)多層次、多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)干預(yù)、調(diào)節(jié)肝纖維化進(jìn)程，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

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