王 冠,黃 楹,馮珂珂,李耀華,王增良

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300151;2天津環(huán)湖醫(yī)院)

膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長,預(yù)后較差,瘤組織內(nèi)的血管密度與其惡性程度及預(yù)后呈正相關(guān)。血管抑素(AS)是近年來發(fā)現(xiàn)最有效的血管生成抑制劑之一,但其在血液循環(huán)中半衰期很短,很快被清除,故效果欠佳。基因轉(zhuǎn)移方法能在局部持續(xù)表達(dá)抗血管生成蛋白。環(huán)磷酰胺(CTX)是臨床常用的氮芥類藥物。2008年 3月 ～2009年 2月,我們采用腺相關(guān)病毒為載體AS重組質(zhì)粒(AAV-AS)聯(lián)合CTX治療大鼠皮下膠質(zhì)瘤,效果較好。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 材料 C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系;健康SD大鼠24只,體質(zhì)量270～320 g,雌雄不限;AAV-AS質(zhì)粒,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建;CTX,細(xì)胞凋亡染色檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) 將C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RMPI1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 d換液 1次。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心后,用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)基吹打后計(jì)數(shù),再次離心洗去血清及胰酶;加入不含血清的RMPI 1640中制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 107/ml。

1.2.2 大鼠膠質(zhì)瘤模型的建立與分組 將C6細(xì)胞接種于24只SD大鼠右側(cè)腹股溝皮下,7 d后腫瘤長至 250～280mm3時(shí)將大鼠隨機(jī)分為 4組各 6只。對(duì)照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水 0.1 ml,連續(xù)注射4 d,間隔3 d后重復(fù),共3個(gè)療程;CTX組腹腔內(nèi)注射CTX 20mg/kg,療程同對(duì)照組;AAV-AS組一次性腹腔內(nèi)注射0.1 ml AAV-AS(3×109pfu/ml);聯(lián)合組腹腔內(nèi)注射AAV-AS、CTX,劑量及給藥時(shí)間同前。

1.2.3 腫瘤體積觀察 開始治療后每隔3 d以電子游標(biāo)卡尺測量并記錄腫瘤長徑(L)和短徑(W),根據(jù)公式V=π/6×LW2計(jì)算腫瘤體積。

1.2.4 膠質(zhì)瘤組織中微血管密度(MVD)測算 采用免疫組化染色法標(biāo)記抗CD31抗體計(jì)算MVD。于治療后第 22天處死大鼠,取腫瘤組織。每個(gè)腫瘤取最外邊、中心和次外邊 5個(gè)切片,每切片隨機(jī)選擇10個(gè)100倍視野(HP,0.24mm2)的血管平均數(shù)量。

1.2.5 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法。腫瘤組織切片,依次經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,20 μg/m l蛋白酶K消化20 min,0.1%Triton檸檬酸鈉緩沖液洗滌5 min(4℃)后,滴加50μl TUNEL混合液于切片上,37℃孵育l h,PBS漂洗后,滴加50μl Converter POD于切片上,37℃孵育30 min, PBS沖洗后,0.05%DAB顯色15～20 min。于暗背景視野內(nèi),呈亮色的點(diǎn)為發(fā)生凋亡的細(xì)胞,進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) ×100。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較使用Bonfferoni t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腫瘤體積比較 對(duì)照組腫瘤體積為(2 060.339±82.028)mm3,CTX組為(1 763.867± 124.237)mm3,AAV-AS組為(1 229.910±141.646) mm3,聯(lián)合組為(1 098.320±70.880)mm3,聯(lián)合組與其他組比較,P均＜0.05。

2.2 各組腫瘤組織MVD比較 對(duì)照組MVD為(20±3)條/HP,CTX組為(18±5)條/HP,AAV-AS組為(13±2)條/HP,聯(lián)合組為(8±3)條/HP,聯(lián)合組與其他組比較,P均＜0.05。

2.3 各組腫瘤細(xì)胞AI比較 對(duì)照組AI為1.442 ±0.329,CTX組為1.719±0.464,AAV-AS組為3.653±0.238,聯(lián)合組為 3.886±0.361,聯(lián)合組與對(duì)照組及CTX組比較,P均＜0.05,但與AAV-AS組比較,P＞0.05。

3 討論

O′Reilly等于1994年從Lewis肺癌大鼠的血清和尿液中分離出相對(duì)分子質(zhì)量為38 kD的蛋白,即為AS。研究表明,AS能特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而對(duì)其他類型的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖無影響[1]。因此,利用血管生成抑制劑特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,理論上可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移而不影響其他宿主細(xì)胞[2]。但 AS半衰期很短,在血液循環(huán)中很快就被清除,因此如果要維持病灶局部的濃度以達(dá)到治療效果,就需要長時(shí)間持續(xù)用藥,治療費(fèi)用非常昂貴。

將病毒作為基因治療載體首先需要考慮的是其安全性,特別是需要大量的病毒作為治療性基因傳遞的載體。AAV具有其他病毒載體所沒有的優(yōu)勢,即野生型AAV不會(huì)產(chǎn)生任何人類疾病。將AAV用于基因治療實(shí)驗(yàn)至今,尚未發(fā)現(xiàn)AAV載體引起的組織炎癥及其他細(xì)胞免疫反應(yīng)[3];并且AAV的DNA微陣列研究表明,AAV的基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞突變的作用非常小[4]。研究表明,轉(zhuǎn)導(dǎo) AAV后,肌內(nèi)、支氣管內(nèi)、肝動(dòng)脈和視網(wǎng)膜下可檢測到較低水平和暫時(shí)存在的AAV;分析患者體液也顯示,AAV在尿、唾液和血清中可以短期存在。其在體內(nèi)被宿主細(xì)胞免疫清除時(shí)間不超過 6周[5]。基因治療是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入患者體內(nèi),表達(dá)相關(guān)蛋白并發(fā)揮相關(guān)功能,最終達(dá)到直接或間接治療腫瘤的目的[6]。但現(xiàn)階段血管抑制基因治療也存在不足之處,因其作用機(jī)理不是直接殺死腫瘤細(xì)胞,而是通過抑制血管的生成而使腫瘤因缺乏養(yǎng)分停止生長,大部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死,但有部分瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)。這些休眠的腫瘤細(xì)胞在血管促進(jìn)生長因子的作用下,可以重新復(fù)蘇[7]。所以,血管抑制療法需聯(lián)合其他方法,才有希望治愈腫瘤。本研究顯示,單純應(yīng)用AAV-AS治療可明顯抑制腫瘤體積生長,使新生血管密度降低,病灶內(nèi)凋亡細(xì)胞增多,證實(shí)AAV-AS可以通過抗血管生成途徑達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤生長的作用。

CTX是臨床常用的氮芥類藥物,其抗血管生成作用表現(xiàn)為雙階段性,在低劑量階段表現(xiàn)為對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抑制作用,在高劑量階段表現(xiàn)為非選擇性的細(xì)胞毒作用[8]。本研究采取低劑量、高頻率給藥方法,從而避免了大劑量給藥產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本研究發(fā)現(xiàn),CTX可抑制腫瘤體積生長、減低血管密度,但對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡無影響,其原因可能與我們采用低劑量CTX化療有關(guān)。其作用機(jī)制為抗血管生成途徑抑制腫瘤的生長,從而間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,而非直接殺滅腫瘤細(xì)胞。

本研究也顯示,聯(lián)合組與其他三組相比,對(duì)腫瘤體積及血管內(nèi)皮生長的抑制具有顯著性,但聯(lián)合治療與單獨(dú)應(yīng)用基因治療對(duì)腫瘤細(xì)胞AI的影響在本研究中未體現(xiàn)出顯著差異,其原因可能是聯(lián)合治療低劑量CTX表現(xiàn)為抗血管生成作用,而非直接殺滅腫瘤細(xì)胞的結(jié)果。CTX作用機(jī)制為促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,而AAV-AS則是特異性的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,在抗血管內(nèi)皮生長方面兩者具有協(xié)同作用。兩種方法聯(lián)合使用既填補(bǔ)了單獨(dú)應(yīng)用化療藥物所產(chǎn)生的間歇期空白,減輕化療的不良反應(yīng),同時(shí)又能夠彌補(bǔ)基因治療的不穩(wěn)定性及局限性。在此條件下,可使原發(fā)灶維持在休眠狀態(tài),抑制轉(zhuǎn)移灶的形成和擴(kuò)展,從而延緩病情發(fā)展,爭取再次手術(shù)機(jī)會(huì)。

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