劉西祿，李國(guó)樓，趙小琳

(1濰坊市中醫(yī)院，山東濰坊261041;2濰坊市人民醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著婦女的健康。在乳腺癌發(fā)生過程中，除DNA序列改變外，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谄湫纬蛇^程中也具有重要作用。表觀遺傳學(xué)研究基因表達(dá)的變化，但不涉及DNA序列的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入的一種機(jī)制。DNA甲基化是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化，將活性甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的C 5位上，形成5-甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程，是一種表觀遺傳修飾。最近的研究證明，在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞侵襲性不斷增強(qiáng)的過程中，表觀遺傳學(xué)的改變，特別是抑癌基因的異常甲基化在腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用。近年來，對(duì)乳腺癌DNA異常甲基化的研究逐漸成為熱點(diǎn)。現(xiàn)就其研究進(jìn)展綜述如下。

1 乳腺癌相關(guān)基因甲基化

1.1 人乳腺癌易感基因1(BRCA1)BRCA1由Miki等于1994年最早報(bào)道，位于染色體17q21，編碼1 863個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，為具有遺傳傾向的乳腺癌、卵巢癌的易感基因。目前研究認(rèn)為，在約50%的遺傳性乳腺癌中，BRCA1的可遺傳性突變是主要的分子機(jī)制。而在散發(fā)性乳腺癌病例中，BRCA1突變并不常見。Catteau等［1］應(yīng)用Southern印跡法分析96例散發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌中BRCA1啟動(dòng)子甲基化情況，11%的BRCA1啟動(dòng)子高度甲基化，且與ER、PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Valgerdur等［2］應(yīng)用MSPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)有9.1%(13/143)的散發(fā)性乳腺癌BRCA1發(fā)生甲基化，并通過FISH和免疫組化檢測(cè)BRCA1定位和蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)9例有明顯的表達(dá)下降或缺失，并與ER的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但與PR無相關(guān)性?？梢?，在散發(fā)性乳腺癌中，甲基化改變是BRCA1基因失活的重要機(jī)制之一。

1.2 p16 位于染色體9p21，編碼細(xì)胞周期依賴蛋白激酶的抑制因子p16INK4A，p16INK4A通過結(jié)合并抑制細(xì)胞周期依賴的蛋白激酶CDK4和CDK6，使Rb磷酸化程度降低來調(diào)控細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變。p16INK4A基因編碼兩種不同的蛋白質(zhì)，即p16INK4A和p19ARF。這兩種轉(zhuǎn)錄體具有相同的第2和第3外顯子，但其第1外顯子不同。p16啟動(dòng)子甲基化或點(diǎn)突變是許多腫瘤的一般特征，在肺癌、結(jié)腸癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、肝癌當(dāng)中都檢測(cè)出p16啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。人類乳腺癌細(xì)胞系和10%～55%原發(fā)性乳腺癌的啟動(dòng)子5'端和第1外顯子區(qū)域發(fā)生甲基化，甲基化表型與mRNA水平下降及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平降低有關(guān)［3］。曹新等［4］研究39例乳腺癌患者，有11例發(fā)生甲基化，其頻率與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Ⅰ期患者甲基化明顯高于Ⅱ、Ⅲ期者。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者甲基化明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者。

1.3 組織金屬蛋白酶抑制物3(TIMP3) 該基因位于人類染色體22q12.1～13.2上，編碼TIMP3蛋白。該蛋白在細(xì)胞外合成后被分泌到細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中，通過抑制組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來降低腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［5］。Lui等［6］用MSPCR法研究了173例浸潤(rùn)性乳腺癌 TIMP3基因的甲基化狀況，有20.81%發(fā)生甲基化，并與腫瘤的分級(jí)、ER、PR、C-erb-2的過表達(dá)有關(guān)。而正常組織中未發(fā)現(xiàn)TIMP3基因甲基化。

1.4 人毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因(ATM) 目前，針對(duì)ATM的研究不斷增多，該基因位于人類染色體的11q22～23［7］，主要參與DNA損傷識(shí)別和修復(fù)，參與多個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞周期關(guān)卡G1/S、S、G2/M，通過相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，介導(dǎo)特定的分子間相互作用，激活或抑制相應(yīng)的細(xì)胞因子，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。Vo等［8］針對(duì)ATM啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)了特異的甲基化引物，檢測(cè)了23例局部晚期乳腺癌的ATM甲基化狀況，其中有18例發(fā)生甲基化，同時(shí)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)其mRNA的表達(dá)水平與啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)有關(guān)。Brandes等［9］通過一套新開發(fā)出的甲基化引物設(shè)計(jì)程序檢測(cè)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的ATM甲基化狀況，并沒有發(fā)現(xiàn)存在甲基化，得出ATM甲基化在乳腺癌中并不是頻發(fā)事件。對(duì)于文獻(xiàn)中結(jié)果不一致的現(xiàn)象，可能是引物設(shè)計(jì)的非特異性所致。對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是否調(diào)節(jié)ATM基因的表達(dá)，學(xué)術(shù)界還存在爭(zhēng)論。

1.5 脆性組氨酸三聯(lián)體基因(FHIT) 該基因是Ohta等［10］在1996年確定并克隆出來的一個(gè)候選抑癌基因，它屬于組氨酸三聯(lián)體基因家族，定位于染色體3p14.2區(qū)域。Sabinl等［11］對(duì)39例原發(fā)性乳腺癌進(jìn)行研究，甲基化率為31%，用免疫組化方法對(duì)FHIT基因的甲基化及其蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者有密切的聯(lián)系。Yang等［12］研究了46例散發(fā)性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，甲基化率達(dá)48%(22/46)，并檢測(cè)到46例患者有67%(31/46)的FHIT基因異常表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)FHIT基因的LOH與異常甲基化有明顯的正相關(guān)性。

1.6 維甲酸受體β2(RARβ2) 維甲酸A受體(RAR)和維甲酸X受體(RXR)，各有三個(gè)亞型，α、β、γ屬于核受體超家族。RARβ基因位于染色體3p24，在抑制某些特定腫瘤如乳腺癌、肺癌的生長(zhǎng)中有重要作用。RARβ2在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)減少或缺失，基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化被認(rèn)為是其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一。在正常的乳腺組織和人類腺上皮細(xì)胞中RARβ 未發(fā)生甲基化［13］。

2 DNA甲基化在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用

在乳腺腫瘤中高頻率出現(xiàn)的甲基化基因可作為臨床診斷、病程監(jiān)控的分子標(biāo)志物。Evron等［14］通過比較細(xì)胞和導(dǎo)管洗出液中 Cyclin D2、RARβ2及 Twist啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，率先提出將DNA甲基化的表觀遺傳分析用于早期乳腺癌的檢測(cè);另外，他們發(fā)現(xiàn)某些健康婦女當(dāng)中也有甲基化存在，后隨訪發(fā)現(xiàn)這些人群都患有乳腺癌。這一結(jié)果給DNA甲基化是否能夠作為乳腺癌早期診斷的方法提供了證據(jù)。

經(jīng)研究證實(shí)，結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因在原位癌和不同分期的乳腺癌均有甲基化發(fā)生，而在非乳腺癌組織中甲基化發(fā)生頻率很低［15］，這對(duì)早期乳腺癌的診斷有一定臨床意義。

Umbricht等［16］研究表明，在重度非典型增生組織、原位癌、浸潤(rùn)性乳腺癌中14-3-3 sigma都發(fā)生甲基化，并且基因表達(dá)下調(diào)，這或許會(huì)為早期乳腺癌的診斷提供依據(jù)。Ferguson等［17］發(fā)現(xiàn)，在91%(75/82)的乳腺癌中14-3-3 sigma被檢測(cè)出有甲基化，并且與基因的表達(dá)失活有關(guān)，而LOH和基因突變的發(fā)生率很低。因此他們認(rèn)為，在乳腺癌中LOH和基因突變并不是引起14-3-3 sigma表達(dá)缺失的主要機(jī)制，而其啟動(dòng)子CpG富集區(qū)的高甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄失活或許會(huì)說明這一點(diǎn)。Moreira等［18］通過 Western blot、2D-PAGE 和免疫組化技術(shù)研究65例乳腺癌組織的14-3-3 sigma蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)并不是乳腺癌中的頻發(fā)事件。Martínez-Galán等［19］通過SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量甲基化PCR檢測(cè)血清中ESR1和14-3-3 sigma基因的甲基化狀態(tài)，與正常人群比較，乳腺癌患者中兩種基因發(fā)生甲基化的頻率較高，兩種基因同時(shí)發(fā)生甲基化時(shí)其敏感性和特異性分別為81%和88%。

RASSF1A基因是Dammann等利用酵母雙雜交篩選方法首次發(fā)現(xiàn)，其定位于3p21.3［20］。RASSF1A基因的作用途徑主要有促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)微管穩(wěn)定性等3個(gè)方面。Dulaimi等［21］發(fā)現(xiàn)，在65%(22/34)各級(jí)各期乳腺癌組織中RASSF1A基因都發(fā)現(xiàn)異常甲基化，在相應(yīng)的血清當(dāng)中甲基化的發(fā)生率也比較高，而在正常的乳腺組織及相應(yīng)的血清中未發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因發(fā)生甲基化。Honorio等［22］檢測(cè)乳腺癌組織時(shí)發(fā)現(xiàn)65%的浸潤(rùn)性乳腺癌和42%的浸潤(rùn)性乳腺癌中的導(dǎo)管原位癌成分RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化而正常對(duì)照為陰性，然而在10例單純導(dǎo)管原位癌中有3例發(fā)現(xiàn)RASSF1A甲基化。這些現(xiàn)象提示RASSF1A在乳腺癌的失活頻率很高，RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化是乳腺癌發(fā)生的早期事件，在乳腺癌的早期診斷中有廣闊的應(yīng)用前景。

Subramaniam等［23］通過MSP和免疫組化技術(shù)研究63例乳腺癌組織的RUNX3甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)，在75%的乳腺癌組織中檢測(cè)出RUNX3基因的異常甲基化，在正常乳腺組織中只有10%;同時(shí)在91%發(fā)生甲基化的乳腺癌組織中，RUNX3基因表達(dá)失活。上述結(jié)果證實(shí)，檢測(cè)RUNX3基因的甲基化狀態(tài)對(duì)乳腺癌的早期診斷有一定價(jià)值。

Lewis等［24］檢測(cè)了27例乳腺癌和55例未患病的高危婦女的乳腺組織中 RASSF1A、APC、H-cadherin、RARβ2 和Cyclin D2基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)Cyclin D2基因在57%的腫瘤組織中有甲基化異常，但在未患病的高危婦女中只發(fā)現(xiàn)1例;同時(shí)，更為重要的是，與中低危易患病婦女比較，在高危婦女中RASSF1A(70%和29%)和APC(56%和20%)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化出現(xiàn)的更為頻繁，這有助于推測(cè)罹患良性乳腺腫瘤發(fā)展為乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn);另外，Cyclin D2甲基化幾乎只在乳腺癌組織中出現(xiàn)，并且可以在血清或乳頭抽吸液中進(jìn)行檢測(cè)，這有可能作為乳腺癌早期診斷的標(biāo)志應(yīng)用于臨床。

現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了乳腺癌中特有的一些基因的甲基化改變，但甲基化作為乳腺癌早期診斷的指標(biāo)也存在很大局限性，需要依賴許多條件，單一的某段DNA序列的甲基化模式的改變不能作為腫瘤早期診斷指標(biāo)，選取最具有乳腺癌代表性的基因是目前該項(xiàng)技術(shù)是否能得到充分應(yīng)用的最大門檻。

3 DNA甲基化與乳腺癌的預(yù)后

隨著對(duì)甲基化與腫瘤發(fā)展相關(guān)性研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，甲基化改變與傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)之間存在著密切聯(lián)系。經(jīng)研究［25］證實(shí)，在早期乳腺癌中，PITX2基因甲基化與患者預(yù)后相關(guān)。Maier等［26］研究了109例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，同時(shí)接受他莫昔芬治療。他們應(yīng)用甲基化芯片分析了117個(gè)候選基因，隨后用Realtime PCR定量分析，發(fā)現(xiàn)PITX2甲基化與無轉(zhuǎn)移生存顯著相關(guān)，這個(gè)結(jié)果在之后的兩個(gè)獨(dú)立的多中心研究中得以證實(shí)。其中一個(gè)研究的是236例冰凍組織［27］，另一個(gè)是399例石蠟包埋組織［28］，這兩項(xiàng)獨(dú)立的多中心研究結(jié)果表明，PITX2基因甲基化是評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的可能的生物學(xué)指標(biāo)。

4 DNA甲基化與乳腺癌的治療

DNA甲基化導(dǎo)致的基因失活與基因突變或缺失不同，它不改變DNA序列，因此改善其甲基化狀態(tài)有可能使基因恢復(fù)表達(dá)，這也為腫瘤的治療提供了新思路。

5-氮-2-脫氧胞苷是一種特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，它主要通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合使其失活。Hartsough等［29］報(bào)道用低濃度5-氮-2-脫氧胞苷處理11株人乳腺癌細(xì)胞，其中5株因甲基化而失活的nm23基因重新表達(dá)，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移傾向明顯降低。

ER的表達(dá)與否是預(yù)測(cè)乳腺癌內(nèi)分泌治療敏感性的標(biāo)志物。迄今為止，未發(fā)現(xiàn)ER基因的遺傳學(xué)改變(如同源缺失、LOH、基因突變等)對(duì)ER表達(dá)缺失起作用。有研究表明，在中國(guó)的原發(fā)性乳腺癌患者中，ERα基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是導(dǎo)致其基因功能失活的主要原因，用去甲基化試劑處理乳腺癌細(xì)胞，ER基因CpG島部分脫甲基化，ER表達(dá)增加。因此，ER的甲基化狀態(tài)可以作為預(yù)防標(biāo)志物和抗癌治療的新靶點(diǎn)。

目前，在腫瘤甲基化抑制方面的治療還不成熟，藥物使用的種類、給藥途徑和藥物使用時(shí)間等問題還沒有解決，并且現(xiàn)在所使用的藥物在療效和降低不良反應(yīng)等方面都不令人滿意。因此，在臨床應(yīng)用上需要進(jìn)一步篩選特異性更強(qiáng)、敏感性更高的甲基化基因，尋找更方便的DNA甲基化檢測(cè)方法及研制其他不良反應(yīng)低的去甲基化藥物，以達(dá)到能夠早期診斷、有效安全治療和對(duì)預(yù)后正確判斷的目的。

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