劉其雨,李 立,李曉延,陳 剛,趙英鵬,白建華,朱新鋒
(昆明市第一人民醫(yī)院,昆明650034)
鈣神經(jīng)素抑制劑他克莫司(FK506)是一種用于預(yù)防肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)的免疫抑制劑,但其藥代動力學(xué)個體差異較大、治療窗口狹窄,很難確定針對所有患者的固定劑量。研究發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致FK506血藥濃度存在個體差異最主要的原因,在于肝臟對藥物的代謝和清除。近來,有關(guān)FK506藥代動力學(xué)與藥物遺傳學(xué)的研究備受重視,其中細胞色素P450酶系的CYP3A5研究較多。2008年1月1日~2010年9月31日,我們對67例接受原位肝移植術(shù)患者的CYP3A5進行基因多態(tài)性分析,探討其對肝移植術(shù)后FK506用量的指導(dǎo)作用。
1.1 臨床資料 選擇在我院接受原位肝移植術(shù)的患者67 例,其中男58 例、女9例,年齡(48.1 ±9.5)歲,體質(zhì)量(57.8±11.3)kg;其中 A 型血20例,B型21例,AB型8例,O型18例。術(shù)后免疫抑制治療方案均采用FK506+嗎替麥考酚酯(MMF)+皮質(zhì)類固醇三聯(lián),F(xiàn)K506初始劑量0.05 mg/(kg·d),術(shù)后7 d達到目標(biāo)血藥濃度7~10 ng/ml。
1.2 CYP3A5基因多態(tài)性檢測 抽取患者外周血1 ml于抗凝管中,氯仿抽提法提取其基因組DNA,采用DNA直接測序法測序。方法如下:單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點對應(yīng)rs776746;引物設(shè)計:CYP3A5的上游引物為5'-CTTCTCCCCTCAAGTCCTCA-3',下游引物為5'-CACAGGGAGTTGACCTTCATAC-3',堿基數(shù)為609 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μl,其中模板1 μl、正反向引物均為 1 μl、dNTP 10 mM 1 μl、10 ×PCR Buffer(不含 Mg2+)5 μl、25 mM MgCl25 μl、Taq酶 0.5 μl、水 35.5 μl。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3min,94 ℃變性45 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸90 s,共循環(huán)35個周期,最后一個周期于72℃修復(fù)延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后經(jīng)PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(上海生工 SK1141)回收產(chǎn)物,于3730測序列分析儀直接測序,最終判定CYP3A5基因的SNP。
1.3 FK506全血谷濃度檢測 于服藥后1周、2周、1個月抽取患者外周抗凝血1 ml,采用ELISA法檢測FK506全血谷濃度。計算各時點全血谷濃度(C)與每千克體質(zhì)量每天劑量(D)比值(C/D)。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較經(jīng)方差齊性檢驗,采用One-Way ANOVA分析;兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 CYP3A5基因多態(tài)性檢測結(jié)果 67例肝移植患者中,CYP3A5 A/A(*1/*1)基因型即野生純合型15例,CYP3A5 A/G(*1/*3)基因型即雜合型23例,CYP3A5 G/G(*3/*3)基因型即突變純合型29例,發(fā)生頻率分別為 22.4%、34.3%、43.3%;CYP3A5表達型(CYP3A5*1/*1或CYP3A5*1/*3)38例,CYP3A5非表達型(CYP3A5*3/*3)29例,發(fā)生頻率分別為 56.7%、43.3%。
2.2 CYP3A5不同基因型肝移植患者術(shù)后FK506的C/D值比較 CYP3A5*1/*1基因型患者術(shù)后1周、2周、1個月FK506的C/D值分別為104.20±61.23、108.12 ± 68.91、112.05 ± 86.51,CYP3A5*1/*3 基因型患者分別為106.12 ±47.84、103.87 ±60.23、111.25 ± 63.24,CYP3A5*3/*3 基因型患者分別為124.62 ±61.43、167.52 ±69.35、151.98 ±78.67。CYP3A5*3/*3基因型與 CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3基因型患者術(shù)后FK506的C/D值比較,P 均 <0.05。
CYP3A5基因具有多個SNP,CYP3A5在中國人的突變率為71% ~76%,其中CYP3A5在內(nèi)含子3的6 986位點 SNP(A>G)起主要作用。根據(jù)CYP3A5多態(tài)性的命名原則,CYP3A5的6 986位點SNP的野生純合型(AA)命名為CYP3A5*1/*1,突變純合型(GG)命名為CYP3A5*3/*3,雜合型命名為CYP3A5*1/*3。由于6 986位點SNP(A>G)的存在,mRNA剪切位點發(fā)生改變,產(chǎn)生了一個終止密碼子,翻譯提前終止,產(chǎn)物為一個截斷蛋白質(zhì);從而使得突變型純合子個體CYP3A5*3/*3基因型者不能表達有酶活性CYP3A5蛋白質(zhì),為慢FK506代謝型,使CYP3A5*3/*3患者與CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3患者的藥代動力學(xué)顯著不同。目前關(guān)于CYP3A5基因的研究主要集中在臨床腎移植。有學(xué)者[1,2]在腎移植受體中發(fā)現(xiàn),CYP3A5非表達型患者口服FK506清除率的加權(quán)平均值比表達型低48%,并據(jù)此希望通過腎移植受體CYP3A5等的基因分型來優(yōu)化術(shù)后免疫抑制劑的個體化治療。而且有研究[3,4]發(fā)現(xiàn)超過70%的腎移植患者因此受益。在腎移植術(shù)后環(huán)孢霉素、西羅莫司等的使用[5~7],亦有類似的結(jié)果。由于 CYP3A5在肝、腸都有表達,肝臟和受體腸道酶活性及基因型均會對FK506代謝產(chǎn)生一定的影響,究竟影響程度如何,很難定論[8,9]。
本研究發(fā)現(xiàn),肝移植術(shù)后隨著時間的延長,肝臟對FK506的清除率亦會增加,不同基因型患者C/D值漸漸有所差別。其中,基因型CYP3A5*1/*1患者的清除優(yōu)勢得到明顯體現(xiàn),增加了FK506的代謝,而降低了藥物暴露,導(dǎo)致其需要更高劑量的FK506方能達到目標(biāo)血藥濃度;而基因型為CYP3A5*3/*3的患者因不能表達有酶活性CYP3A5蛋白質(zhì),使得其不能充分代謝其底物FK506,僅需相對低劑量的藥物就可以維持其目標(biāo)血藥濃度。在其他實體器官移植中,亦有研究[10,11]發(fā)現(xiàn),相比CYP3A5*3/*3基因型,攜帶CYP3A5*1基因型的受體為了達到目標(biāo)血藥濃度而需要成倍的免疫抑制劑劑量。
CYP3A5基因型與FK506血藥濃度關(guān)系較為密切,這對確定器官移植術(shù)后免疫抑制劑的劑量、改善患者預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn),肝移植患者術(shù)后FK506的用量與CYP3A5基因多態(tài)性有關(guān)。因此,檢測患者CYP3A5的基因多態(tài)性有助于肝移植術(shù)后免疫抑制劑FK506的個性化治療,并加強藥物安全性和有效性,有助于在不增加風(fēng)險和不良反應(yīng)前提下的充分免疫抑制,這為優(yōu)化藥物劑量個體化治療提供有力的理論依據(jù)。
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