王小春，田 靜，李德冠，吳紅英，王月英，孟愛(ài)民

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津300192;2山東省腫瘤醫(yī)院)

Cks1是高度保守的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白SUC1/Cks家族成員之一，是周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的亞基，能與其他周期蛋白依賴性激酶和磷酸化的蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Cks1在乳腺癌組織中高表達(dá)，而且其高表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。2009年5月～2011年5月，我們觀察了抑制Cks1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7，Scrambled siRNA(與人類基因組序列無(wú)同源性)及Cks1 siRNA(5'-GGGACATAGCCAAGCTGGTCgagtactgGACCAGCTTGGCTATGTCCC-3')由Invitrogen公司合成，MTS試劑盒，Transwell小室，蛋白裂解液，兔抗人Cks1、MMP-2、MMP-9(均 1∶500 稀釋)抗體，鼠抗人-actin抗體(1∶5 000 稀釋)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞以6×105/ml接種6孔板，16 h后觀察組細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Cks1 siRNA，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Scrambled siRNA;繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將細(xì)胞按1∶10傳代;然后加入G418進(jìn)行篩選，每隔2～3 d換液1次，10～14 d有明顯克隆形成。

1.2.2 MCF-7細(xì)胞增殖活性觀察 采用MTS法。取6孔板中轉(zhuǎn)染36 h的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml，以 100 μl/孔接種 96 孔板。接種后24、48、72、96 h(即轉(zhuǎn)染 60、84、108、132 h)，每孔加20 μl MTS檢測(cè)試劑，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)時(shí)MCF-7細(xì)胞的OD值，以此表示細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 MCF-7 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力觀察 采用Transwell小室檢測(cè)。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓12 h。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，每個(gè)侵襲小室上室加100 μl細(xì)胞懸液，下室加600 μl含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。其中侵襲實(shí)驗(yàn)在小室接種細(xì)胞前一晚將基質(zhì)膠用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶7，每個(gè)侵襲小室加60 μl，而遷移實(shí)驗(yàn)不加基質(zhì)膠。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，侵襲實(shí)驗(yàn)28 h后再行遷移實(shí)驗(yàn)。取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取4個(gè)低倍視野(×100)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MCF-7 細(xì)胞中的 MMP-2、MMP-9 蛋白檢測(cè)采用Western blot法。用蛋白裂解液提取培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白，用分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度;每孔上樣20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE(濃縮膠8%，分離膠12%);蛋白分離后半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(30 V 42min)，用5%脫脂奶粉室溫(15～25℃)封閉1 h后，加入兔抗人 Cks1抗體、MMP-2、MMP-9，以鼠抗人-actin抗體作為內(nèi)參，4℃搖床過(guò)夜;再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶1 000)和山羊抗小鼠 IgG(稀釋比例1∶1 000)，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。以MMP-2、MMP-9蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為其蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cks1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響 觀察組轉(zhuǎn)染60、84、108、132 h 后，MCF-7 細(xì)胞OD 值分別為0.15 ±0.01、0.3 ±0.02、0.7 ±0.01、1.3 ±0.02，對(duì)照組分別為 0.2 ±0.01、0.5 ±0.01、1.3 ±0.03、1.8±0.02，兩組轉(zhuǎn)染84、108、132 h細(xì)胞 OD 值比較，P均 ＜0.05。

2.2 Cks1對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響觀察組轉(zhuǎn)染48 h，侵襲細(xì)胞數(shù)為(150±17)個(gè)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)為(210±22)個(gè)，對(duì)照組分別(550±90)、(660±96)個(gè);兩組比較，P 均 ＜0.05。

2.3 Cks1對(duì)MCF-7細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染后12 h，觀察組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量為 0.05 ±0.002、0.10 ±0.002，對(duì)照組分別為0.95 ±0.020、0.98 ±0.030，兩組比較，P 均＜0.05。

3 討論

Cks1是高度保守的Cks1/Suc1蛋白家族成員之一，可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶相互作用而影響細(xì)胞周期的進(jìn)展。近年來(lái)的研究表明，Cks1在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Shen等［1］采用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cks1在肝癌組織中高表達(dá)，而且Cks1的表達(dá)與肝癌侵襲性顯著相關(guān)。Zototar等［2］研究發(fā)現(xiàn)，Cks1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，分析表明Cks1表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。Nagler等［3］檢測(cè)了64例唾液腺癌中Cks1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)47%的病例中存在Cks1高表達(dá)，而且其表達(dá)與SKP2、Ki67和p53的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，與p27表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。Slotky等［4］發(fā)現(xiàn)，Cks1在乳腺癌中高表達(dá)，其表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度增高而增高。這些研究結(jié)果提示，Cks1的表達(dá)可能在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。

惡性腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。鑒于Cks1表達(dá)與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性，我們檢測(cè)了Cks1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降Cks1表達(dá)可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖能力，表明Cks1表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能有一定相關(guān)性。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移須完成三個(gè)過(guò)程:即降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白質(zhì)，黏附ECM生長(zhǎng)，離開(kāi)ECM向其他器官轉(zhuǎn)移。在此過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起關(guān)鍵作用。MMPs既參與ECM降解，也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附及運(yùn)動(dòng)［5］。為了進(jìn)一步研究Cks1影響乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了Cks1表達(dá)對(duì)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)敲降Cks1表達(dá)可顯著抑制這兩種蛋白的表達(dá)水平，提示Cks1可以通過(guò)影響MMP-2和MMP-9的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但這種作用是直接的還是間接的需要進(jìn)一步深入研究。

［1］Shen DY，F(xiàn)ang ZX，You P，et al.Clinical significance and expression of cyclin kinase subunits 1 and 2 in hepatocellular carcinoma［J］.Liver Int，2009，30(1):119-125.

［2］Zolotar VG，Tzelepi VN，Leotsinidis M，et al.Histologic-type specific role of cell cycle regulators in non-small cell lung carcinoma［J］.J Surg Res，2009，164(2):256-265.

［3］Nagler RM，Ben-Izhak O，Ostrovsky D，et al.The expression and prognostic significance of Cks1 in salivary cancer［J］.Cancer Invest，2009，27(5):512-520.

［4］Slotky M，Shapira M，Izhak OB，et al.The expression of the ubiquitin ligase subunit Cks1 in human breast cancer［J］.Breast Cancer Res，2005，7(5):737-744.

［5］王璐，張麗紅，李玉林，等.基質(zhì)金屬蛋白酶9及其mRNA在胃癌中的表達(dá)與血管新生的關(guān)系［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(9):782-785.