(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100;2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

心肌缺血可導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧，引起某些核轉(zhuǎn)錄因子的激活，影響干細(xì)胞分化。目前研究發(fā)現(xiàn)［1］，作為一種調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新的核轉(zhuǎn)錄因子Nanog在心肌缺血的發(fā)病機(jī)制中的起重要作用。Nanog是一種存在于哺乳動(dòng)物多潛能細(xì)胞和發(fā)育中的胚胎細(xì)胞中的同源結(jié)構(gòu)域蛋白，它不僅對(duì)胚胎細(xì)胞的形成特別重要，而且對(duì)體細(xì)胞多潛能表達(dá)也起調(diào)節(jié)作用［2］。2009年8月～2010年3月，我們采用RT-PCR和Western blot法觀察急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達(dá)變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選用健康SD雄性大鼠30只(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量180～220 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(正常組)和Q1、Q2、Q3、Q4組，各6只。后四組采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立心肌缺血模型［3］，以結(jié)扎后心前壁顏色變暗和ST段明顯抬高0.15 mV確定建模成功。正常組除不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支外，余相同。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒，Nanog兔抗鼠多克隆抗體，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，PVDF膜(孔徑0.45 μm，ECL-Western blot試劑盒等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 各組心肌組織中Nanog mRNA及蛋白檢測(cè)

1.3.1 各組心肌組織中Nanog mRNA檢測(cè) 取正常組心肌組織，Q1、Q2、Q3、Q4組分別于心肌缺血2、6、12、24 h時(shí)取心肌組織，采用 RT-PCR 法檢測(cè)。先提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，半定量RT-PCR擴(kuò)增 Nanog、β-actin cDNA片斷。Nanog上下游引物序列分別為5'-ATGCCTGTGATTTGTGGGCC-3'、5'-GCCAGTTGTTTTTCTGCCAC-3'，β-actin上下游引物序列分別為5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'、 5'-GCTCAGGATCTTCATGAGGT-3'。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。予以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果拍照后用圖像分析灰度掃描，進(jìn)行半定量分析。以Nanog與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度值比值為Nanog mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 各組心肌組織中Nanog蛋白檢測(cè) 各組心肌組織提取同1.3.1。所有標(biāo)本－78℃保存，采用Western blot法檢測(cè)各組心肌組織中Nanog蛋白。以β-actin為內(nèi)參照。將蛋白印跡顯影圖像掃描，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，以Nanog蛋白灰度值與內(nèi)參照 β-actin灰度值比值為Nanog蛋白相對(duì)灰度值(灰度值與蛋白表達(dá)量成反比)。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織中Nanog mRNA表達(dá)結(jié)果 正常組和 Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中 Nanog mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 0.14 ±0.04、0.15 ±0.04、0.51±0.07、0.34 ± 0.04、0.11 ± 0.04。以 Q2、Q3 組Nanog mRNA表達(dá)最高(P均＜0.05)。

2.2 各組心肌組織Nanog蛋白表達(dá)結(jié)果 正常組和Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中Nanog蛋白相對(duì)灰度值分別為 3.46 ±0.37、2.59 ±0.09、2.14 ±0.98、2.44 ±0.31、3.53 ±0.55。以 Q2、Q3 組蛋白表達(dá)最高(P 均 ＜0.05)。

3 討論

有研究認(rèn)為［4］，Nanog基因是“逆轉(zhuǎn)因”物質(zhì)，可以把普通細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ゼ?xì)胞，再指導(dǎo)新細(xì)胞生長(zhǎng)出人類需要的各種人體組織，來(lái)代替已失去功能的組織器官。最新研究表明［5］，Nanog與另兩個(gè)重要核轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2同位于細(xì)胞全能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端，是保持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的中心物質(zhì)，它們與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白或轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)ES細(xì)胞的自我更新和全能性;同時(shí)通過(guò)調(diào)控在生物發(fā)育進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的可阻遏基因從而調(diào)節(jié)與分化有關(guān)的下游基因，調(diào)控生物的發(fā)育過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)中，我們首先建立了急性心肌缺血模型，采用RT-PCR和Western blot方法從基因和蛋白水平對(duì)缺血心肌組織中Nanog進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白呈微量表達(dá)，心肌缺血后2～12 h，心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，以6～12 h增加顯著，12 h后有所下降，24 h時(shí)呈幾乎不表達(dá)，提示心肌缺血組織中Nanog表達(dá)明顯上調(diào)，其原因可能是心肌損傷后的修復(fù)反應(yīng)，Nanog高表達(dá)有利于心肌細(xì)胞增殖［6，7］。目前有關(guān)Nanog蛋白的作用靶點(diǎn)尚不十分清楚。Nanog蛋白作為一種轉(zhuǎn)分化抑制因子，并不終止已定型的終末分化細(xì)胞，因此高度分化的心肌細(xì)胞，還可重新啟動(dòng)Nanog基因，合成Nanog蛋白，調(diào)節(jié)和促進(jìn)心肌細(xì)胞再進(jìn)入分裂循環(huán)［8］。

所以我們推測(cè)Nanog是心肌缺血后心臟病理生理改變的重要因素之一。缺血心肌組織中Nanog表達(dá)變化，可能在缺血后心肌重構(gòu)過(guò)程中有著重要的作用，至于其作用機(jī)制及對(duì)心功能的影響等尚待進(jìn)一步研究。

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