(1河北大學醫(yī)學部，河北保定 071000;2河北大學圖書館;3河北大學預防與衛(wèi)生管理系)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路參與調(diào)節(jié)大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。EGF是EGFR的配體，EGF對膠質(zhì)瘤的影響機制并不十分清楚。2010年6～8月，我們觀察不同濃度的EGF對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251增值能力的影響，探討EGF在細胞信號傳導通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 膠質(zhì)瘤細胞株U251為本校實驗室凍存。EGF(Sigma公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成1 000 ng/ml母液，分裝后－86℃保存。實驗前用新鮮DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液按比例稀釋至終濃度，冰上避光操作。MTT(Sigma公司)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體及免疫組化其他試劑(福州邁新生物有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 U251用含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液加1%雙抗(青霉素、鏈霉素)，0.25%胰酶消化傳代。

取對數(shù)生長期的細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，再用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 1 ×104，接種于96 孔板上，每孔180 μl，設(shè)空白對照孔。分別加入10、50、100、200 ng/ml的EGF作用24 h(實驗組)，以不加EGF的細胞為對照組。各設(shè)5個復孔，37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.3 觀測指標及方法 ①U251形態(tài):采用倒置顯微鏡觀察。②細胞增殖力:采用MTT法檢測U251細胞增殖力。酶標儀設(shè)570 nm為檢測波長，測各孔的吸光度值(A值)。③U251中 Ki-67:取對數(shù)生長期細胞滴加在多聚賴氨酸處理的無菌載玻片上，細胞爬滿載玻片后經(jīng)冷丙酮固定15 min，采用免疫組織化SP法檢測細胞中Ki-67。以細胞核呈棕黃或棕褐色為陽性細胞，在高倍鏡(400×)下隨機選取10個視野，以陽性染色的細胞數(shù)與所測細胞數(shù)的比為增殖指數(shù)(PI)［1］。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，采用方差分析，計數(shù)資料用χ2檢驗。α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 U251的形態(tài)學改變 與對照組比較，實驗組貼壁瘤細胞數(shù)量明顯增加，排列密集，不同劑量的EGF能夠促進細胞生長。

2.2 兩組細胞增殖力比較 與對照組比較，實驗組中加入10、50、100、200 ng/ml EGF的細胞A值隨著EGF濃度的提高而增加，100 ng/ml時A值最高，呈劑量—效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05);與加入100 ng/ml EGF的細胞A值比較，加入200 ng/ml EGF的細胞A值下降(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 不同濃度EGF對U251細胞增殖的影響

2.3 兩組U251中Ki-67 PI比較 對照組Ki-67 PI為16.2 ±1.9;實驗組中，加入10、50、100、200 ng/ml EGF 的細胞中 Ki-67 PI分別為 23.1 ±1.7、33.9 ±2.8、46.0 ±3.2、20.4 ±1.5。100 ng/ml的 EGF 作用下U251中Ki-67 PI為最高(P＜0.05)。

3 討論

EGF介導的細胞信號傳導通路對腫瘤細胞活性的影響是目前的研究熱點之一。EGF能夠促進細胞增殖，并在細胞分化、新生血管形成方面起一定作用。EGF與EGFR結(jié)合后，引起質(zhì)膜或胞內(nèi)酪氨酸殘基特異蛋白激酶從失活轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?，磷酸化EGFR(p-EGFR)是EGFR活化形式。可激活下游的多種細胞信號傳導通路而促進細胞增殖，調(diào)控細胞的生物學活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在加入一定濃度的外源性EGF(10～100 ng/ml)后，U251 A值隨EGF濃度的增加而增加，表明一定劑量的EGF可以促進U251細胞增殖。與對照組比較，實驗組貼壁瘤細胞數(shù)量明顯增加，排列密集，從形態(tài)學上支持了一定劑量EGF的促細胞增殖效應(yīng)，提示小劑量EGF有促進U251細胞增殖的作用。分析原因這可能與EGF介導的細胞信號傳導通路被活化從而促進了U251生長有關(guān)。

細胞增殖率與腫瘤生長、侵襲能力密切相關(guān)，因此檢測腫瘤增殖活性對腫瘤生物學行為判斷具有重要意義［2］。Ki-67是一種與細胞有絲分裂密切相關(guān)的抗原，與細胞增殖有著密切的關(guān)系，其基因定位在10號染色體上。作為細胞與細胞周期密切相關(guān)的細胞核蛋白，Ki-67是目前認為最重要的細胞增殖標記物［3，4］。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組隨EGF劑量的增加(10～100 ng/ml)，U251中Ki-67 PI增加，Ki-67表達上調(diào)，呈劑量依賴性，說明隨著EGF的劑量增加U251細胞增殖潛能也在不斷地增加。

我們還發(fā)現(xiàn)，當EGF增加至200 ng/ml時，實驗組A值下降，PI也下降，提示高濃度EGF對U251促增殖作用減弱，說明EGF能夠雙向調(diào)節(jié)U251的生物學活性。這與EGF對GL15細胞增殖的影響一致［5］。分析原因可能與EGF的受體消耗以及細胞自身的負反饋有關(guān)，提示我們高濃度EGF對U251的生長抑制作用可為臨床治療膠質(zhì)瘤提供另一條思路。

總之，一定濃度范圍內(nèi)的EGF可促進U251細胞增殖，EGF可以雙向調(diào)節(jié)U251的生物學活性，在細胞信號傳導通路中發(fā)揮重要作用。

［1］崔勇，王洪，方川，等 .人腦膠質(zhì)瘤組織中EGFR、MMP-9、Ki67的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(38):77-78.

［2］Scholzen T，Gerdes J.The Ki-67 protein:from the known and the unknown［J］.J Cell Physiol，2000，182(3):311-322.

［3］DuchrowM，Gerdes J，Schluter C.The proliferation associated Ki67 protein:definition inmolecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27(5):235-242.

［4］Nakano T，Oka K.Differential values of Ki-67 index andmitotic index of proliferating cell population:an assessment of cell cycleand prognosis in radiation therapy for cervical cancer［J］.Cancer，1993，72(8):2401-2408.

［5］席桂發(fā)，王寶峰，王和平，等.EGF和AG1478對GL15細胞增殖、侵襲和GFAP表達的影響［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2007，6(4):302-304.