張 艷 靳衛(wèi)國

(1.泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271000；2.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城 252000)

氧是需氧生物必不可少的基本物質，需氧細胞在物質能量過程中，如果氧未被完全還原成水，可產生氧自由基，這些氧自由基可轉變成一些非自由基氧活性物質，由于功能上的相似性，這些物質被統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，ROS對細胞功能如生長、轉化、凋亡、癌變和衰老發(fā)揮重要的作用。乏氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征，乏氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1) 是各種低氧誘導基因調節(jié)的關鍵轉錄因子, HIF-1 的作用主要取決于HIF-1α亞基的表達和活性。結合兩者近年來的研究進展作簡要綜述。

1 活性氧概述

1.1 活性氧的產生和代謝

細胞的生存離不開氧的供應。ROS是需氧細胞在代謝過程中產生的以各種形式的氧自由基和非自由基形式存在的含氧化合物的總稱。包括超氧陰離子( superoxide anion，O2ˉ)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)及脂質過氧化物(ROOH)。這是一類比分子氧化學反應性更活活潑的一類含氧物質，含有未成對電子，極不穩(wěn)定[1]。

生理情況下，體內大約2%的氧消耗于線粒體內，線粒體是ROS產生的主要場所，呼吸鏈(MRC)[2]中的酶復合體Ⅰ和Ⅲ漏出的電子能與O2結合生成ROS。其他產生ROS的部位包括：NADH氧化物酶復合體途徑[3]、磷脂酶A2激活的花生四烯酸代謝途徑[4]、黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶途徑[5]、蛋白激酶C、脂氧合酶系以及環(huán)氧合酶系等，其中NADH氧化酶系統(tǒng)最重要。

機體在長期進化過程中形成了抗氧化應激機制，正常情況下，細胞產生的少量ROS 可被內源性抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶和抗氧化物質滅活，從而保護細胞免受自身代謝產物的損傷[6,7]。這些抗氧化酶類主要包括：超氧化物岐化酶( superoxide dismutase, SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶( glutathione peroxidase, GPX)及過氧化氫( catalase, CAT)等，而抗氧化物質主要有：還原型谷胱甘肽( reduced glutathione hormone, GSH) 、硫氧還蛋白( thionredoxin, TRX) 、維生素E、胡蘿卜素、維生素C及一些游離氨基酸、多肽及蛋白質等。

1.2 活性氧與腫瘤的發(fā)生機制

在病理情況下，如：氧分壓改變、激素、細胞因子和化學物質等均可引起的ROS 增加。當體內ROS產生數量超過機體抗氧化能力，就會損傷蛋白質、DNA、多糖和脂質，該過程被稱為氧化應激(oxidative stress)。隨著ROS研究的不斷深入，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用已被證實，體內活性氧與抗氧化應激系統(tǒng)的失衡是腫瘤形成的關鍵因素，大量研究結果顯示ROS參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7-9]。

1.2.1ROS導致的DNA損傷 ROS是極強的氧化劑，當其在機體或細胞內聚集可造成DNA損傷，產生DNA斷裂、堿基互換、姐妹染色體交換、DNA加合物形成、染色體基因突變等，這是ROS誘導細胞癌變的主要原因。ROS誘導的DNA氧化性損傷的主要方面是堿基結構的損傷，其中·OH是結構最簡單 、反應活性最高的活性氧。ROS還可通過基因的轉錄和表達來調控細胞多種代謝過程。ROS可氧化DNA結合蛋白質的巰基，從而改變與DNA結合的能力，引發(fā)癌基因的表達。另外，活性氧以協(xié)同方式激活轉錄因子NF-KB 和MAP激酶(絲氨酸/蘇氨酸激酶)，以啟動基因的轉錄影響腫瘤細胞的增殖。

1.2.2ROS導致蛋白質損傷 活性氧對蛋白質的作用包括修飾氨基酸，使肽鏈斷裂，形成蛋白質的交聯(lián)聚合物，改變構象和免疫原性等5個方面。一是修飾氨基酸。蛋白質分子中起關鍵作用氨基酸成分對自由基損害特別敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最為突出，不同的自由基對特定氨基酸側鏈有特殊影響。二是使肽鏈斷裂?；钚匝跛碌鞍踪|肽鏈斷裂方式有2種，一種是肽鏈水解，另一種是從α-碳原子處直接斷裂，究竟以何種方式斷裂取決于活性氧和蛋白質的類別、濃度和二者之間的反應速率。三是形成蛋白質交聯(lián)聚合物。多種機制可以導致蛋白質的交聯(lián)和聚合。蛋白質分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫鍵，兩者均可以形成蛋白質的交聯(lián)。交聯(lián)可以分為分子內交聯(lián)和分子間交聯(lián)2種形式。蛋白質分子中酪氨酸和半胱氨酸的數目可以決定交聯(lián)的形式。另外，脂質過氧化產生的丙二醛與蛋白質氨基酸殘基反應生成烯胺，也可以造成蛋白質交聯(lián)。四是改變構象。蛋白質經氧化后，熱動力學上不穩(wěn)定，部分三級結構打開，失去原有構象。五是改變免疫原性。.

1.2.3ROS對生物膜的損傷 自由基作用于細胞膜及亞細胞器膜上的多不飽和脂肪酸，可使其發(fā)生脂質過氧化反應，脂質過氧化的中間產物可與膜蛋白發(fā)生反應生成蛋白質自由基，使蛋白質發(fā)生聚合和交聯(lián)；另一方面自由基還可直接與膜上的酶或其受體共價結合。這些氧化損傷破壞了鑲嵌于膜系統(tǒng)上的許多酶和受體、離子通道的空間構型，破壞膜的完整性，使膜流動性下降，膜脆性增加，細胞內外或細胞器內外物質和信息交換障礙，影響膜的功能與抗原特異性，導致廣泛性損傷和病變。

1.2.4其它因素 研究表明，ROS可促使致癌物質產生。如：2-氨基-3,4二甲基異吡唑喹啉和2-氨基-3-甲基異吡唑喹啉等雜環(huán)胺類[10]。ROS也可影響端粒酶的活性，而端粒酶通過調控染色體端粒的長短來決定細胞的分裂、分化、衰老和死亡、以及癌變等多種過程。

2 乏氧誘導因子-1α

實體瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于血供系統(tǒng)，新生的腫瘤脈管通常不規(guī)則、異常彎曲、動靜脈短路或呈盲端或血管壁不完整，導致血流緩慢，腫瘤細胞所需的氧氣和營養(yǎng)物質供應不足，乏氧是實體瘤微環(huán)境的基本特征，乏氧不僅改變腫瘤細胞的生物學特性，導致腫瘤細胞的遺傳不穩(wěn)定性及惡性選擇，與腫瘤的生長、浸潤和轉移有關，也是腫瘤對放、化療產生抗性的主要原因之一。

2.1 乏氧誘導因子-1α的結構與功能

在乏氧情況下，腫瘤細胞組織的許多基因都會對乏氧做出應激反應，在該過程中起中樞性調節(jié)作用的因子就是乏氧誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)。 HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子,它是由α和β2個亞基組成的異二聚體。HIF-1α基因定位于染色體14q21～q24,而HIF-1β基因定位于染色體1q21。α和β2個亞基均屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋/PAS ( bHLH-PAS)蛋白家族成員。HIF-1α分子的氨基端方向依次排列著堿性區(qū)域、HLH 和PAS,共同構成轉錄因子DNA結合結構域。HIF-1α羧基端有兩個相對獨立的反式激活結構域( transactivation domain, TAD) ,分別稱之為TAD-N (氨基酸531～575)和TAD-C (氨基酸813～826) ,參與轉錄活化,二者之間為抑制結構域,能降低TAD的活性,常氧下抑制明顯。HIF-1α分子中部是氧依賴降解結構域,控制其常氧降解。HIF-1α是HIF-1所特有的,它既是HIF-1的調節(jié)亞基,又是活性亞基,其蛋白穩(wěn)定性和活性均受細胞內氧濃度的調節(jié),在常氧條件下HIF-1α水平下降明顯,很難檢測到。HIF-1β是許多轉錄因子所共有的亞基,為芳羥受體核轉位子( the aryl hydrocarbon recep tor nuclear translocator,ARNT)基因的產物,又稱芳羥受體核轉運蛋白,具有789或744個氨基酸殘基,僅含一個轉錄激活區(qū),定位于C末端。HIF-1β在細胞內呈構成性表達,不受氧濃度的調節(jié),可存在于任何氧濃度下。只有HIF-1α入核后與HIF-1β形成異二聚體才能成為有活性的HIF-1[11]。研究證明：HIF-1α僅存在于乏氧細胞核內，常氧狀態(tài)下檢測不到，與腫瘤的增殖、浸潤和轉移能力有關。

乏氧狀態(tài)下，腫瘤細胞的多種基因轉錄活性發(fā)生改變，這些基因的啟動子多含有乏氧反應元件(HRE)，HIF-lα通過HRE調節(jié)多種靶基因如：VEGF、EPO、GLUT-1、3和糖酵解酶的表達，影響血管發(fā)生、細胞能量代謝、離子代謝、細胞周期、細胞凋亡、信號傳導等。

2.2 HIF-1α與腫瘤的作用機制

2.2.1HIF-1α與腫瘤的血管生成

在眾多調節(jié)中腫瘤血管形成的因子如：血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor, VEGF) 、表皮生長因子( ep idermal growth factor, EGF)和成纖維細胞生長因子( fibroblast growth factor, FGF)中,乏氧引起VEGF的表達上調已得到公認,上調的VEGF可協(xié)助腫瘤細胞進入脈管系統(tǒng),從而增加腫瘤轉移率。Fang等[12]證實,在腫瘤發(fā)生早期HIF-1α介導了VEGF的上調。Schoppmann等[13]研究發(fā)現(xiàn), HIF-1α與VEGF-C有顯著的相關性,且與微血管密度有明顯關聯(lián)。Skinner等[14]發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達通過活化P I3K/AKT信號通路在轉錄水平介導VEGF蛋白的表達。

2.2.2HIF-1α對腫瘤細胞間黏附的影響

當腫瘤細胞處于低氧狀態(tài)時，腫瘤細胞間黏附力下降，同時侵襲組織和血管的能力增強。研究表明,在諸多與腫瘤細胞浸潤轉移相關的黏附分子中,上皮型鈣粘素( E-cadherin, E-cad)與β鏈接素(β-catenin,β-cat)起重要作用, E-cad /β-cat復合體的破壞可使細胞-細胞、細胞-基質間的黏附性降低,最終導致細胞的分離和移動；同時兩者亦是上皮-間質細胞轉化( epithelial-mesen-chymal transition , EMT)中的關鍵蛋白,而EMT是腫瘤轉移過程中的重要現(xiàn)象。HIF-1α可通過影響腫瘤細胞黏附分子的表達促進腫瘤轉移。在晚期卵巢癌患者腫瘤組織中能檢測到在H IF-1α高表達的同時, E-cad和β-cat在轉錄水平和蛋白水平表達降低。Imai等[15]應用Northern- blotting、RT-PCR和Westernblotting實驗方法發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下卵巢癌細胞系中E-cad的表達明顯減少, 導致細胞間黏附作用減小,促進腫瘤侵襲, 可能是導致卵巢癌細胞侵潤轉移的始動因素, 同時發(fā)現(xiàn)其機制可能是乏氧上調Snail( E-cad轉錄抑制因子) 表達。Ohga 等[16]研究發(fā)現(xiàn)乏氧本身可直接激活NF-κB, 而ICAM-1( 細胞間黏附分子-1) 基因的啟動子含有NF-κB 作用位點, 因此可認為乏氧通過激活NF-κB 進而促進ICAM-1的表達,促進腫瘤侵襲的發(fā)生。Howard等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中E-cad 的表達與HIF-1α的表達明顯相關。

2.2.3HIF-1α對腫瘤細胞凋亡的影響

腫瘤細胞的凋亡有p53依賴性和非依賴性兩條途徑, 而乏氧是通過HIF-1α介導p53 依賴途徑而發(fā)揮作用。Carmeliet 等發(fā)現(xiàn)乏氧時野生型胚胎干細胞(ES,HIF-1α+/+ ) 的HIF-1α和p53 表達均增加。研究表明HIF-1α可選擇性地使p53 突變或p53 缺失的瘤細胞凋亡受阻, 使腫瘤惡性程度更高。Bcl-2為凋亡抑制因子, Bcl-2可通過抑制腫瘤細胞凋亡而增強膀胱癌的轉移能力。Acs等[18]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可調Bcl-2表達，抑制凋亡, 從而增強腫瘤轉移能力。HIF-1α亦可上調凋亡抑制因子p21, 從而抑制凋亡使腫瘤惡性程度增加易于轉移。

3 活性氧對HIF-1α的影響

HIF-1α有1 個氧依賴調節(jié)區(qū)(ODD) ，2 個轉錄活性區(qū)( TAD) 。正常氧分壓條件下，ODD 的2 個脯氨酸殘基( P402 和P564) 被脯氨酸羥化酶( PHD) 羥化，導致HIF-1α與抑癌蛋白VHL 結合，啟動HIF-1α的泛素化和蛋白水解過程。在這一過程中，PHD被確定為氧感受器，其活性受氧分壓調節(jié)。

而更多的研究發(fā)現(xiàn)，無論是缺氧或非缺氧情況，ROS 均參與HIF 活性的調節(jié)。研究表明 HIF-1α對氧依賴性較強，HIF-1α蛋白表達和轉錄活性在mRNA、蛋白、核定位及轉錄激活等不同層次受細胞內氧濃度的精確調控[19]，當周圍環(huán)境的氧濃度下降時，HIF-1α表達增加，與靶基因上的HRE結合[20],誘導下游靶基因的轉錄而產生一系列生物學效應,如：作用于促紅細胞生成素( erythropoietin, EPO)使血紅蛋白合成增加，增強在低氧環(huán)境下的攜氧能力；增加與無氧代謝有關的基因轉錄(包括糖酵解酶、葡萄糖轉運子等)而使ATP生成增加；上調血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達而促進腫瘤新生血管形成；此外還可調節(jié)多種基因的表達,如胰島素樣生長因子-2、內皮素-1、轉鐵蛋白、葡萄糖載體蛋白-1及細胞周期調節(jié)因子等,這些產物參與腫瘤細胞的代謝、生長、凋亡及浸潤轉移等。

研究表明，腫瘤細胞在乏氧狀態(tài)下產生的ROS增多[21]，ROS可通過抑制 PHD活性對HIF-1α發(fā)揮正向調節(jié)作用。而在常氧狀態(tài)下, 腫瘤組織內HIF-1α的含量與活性調節(jié)主要依賴生長因子、血管活性肽和金屬離子等因素,這些因素可通過促進ROS的產生來發(fā)揮調節(jié)作用。另外，許多非低氧刺激因素,如凝血酶、血管緊張素和機械性刺激等，可通過NADPH氧化酶調節(jié)細胞內的ROS水平和HIF-1α[22]?？傊?，乏氧和非乏氧刺激因素均可增加ROS水平，通過PHD、激酶和磷酸酶等上游信號通路，正向調節(jié)HIF-1α水平和活性。

4 結論與展望

實體瘤的發(fā)生發(fā)展機制非常復雜，ROS及機體抗氧化系統(tǒng)的失衡在其中發(fā)揮重要作用，而乏氧是實體瘤發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象。具體機制未完全闡明，繼發(fā)的組織低氧使適應低氧環(huán)境和低血糖的殘存細胞克隆繼續(xù)生長，這是腫瘤細胞浸潤及其對放化療抗拒的最根本原因。HIF-1α無疑成為腫瘤細胞克服缺氧，增強自身適應能力的樞紐環(huán)節(jié)。雖然目前我們對ROS及HIF-1α系統(tǒng)有了一定的認識，但仍有許多未解之謎：①HIF-1α具體的調控機制。②ROS及機體的抗氧化系統(tǒng)的調節(jié)。③ROS對HIF-1α作用的具體影響等。全面詳盡地認識腫瘤內氧代謝異常，對我們認識和治療腫瘤將開辟新的途徑。

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