于敬達(dá) 徐能義 馬淑一 董 弘 李麗娜

（1.包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014060；2.內(nèi)蒙古婦幼保健醫(yī)院遺傳科，內(nèi)蒙古包頭014060）

再生障礙性貧血（再障）是因骨髓造血組織顯著減少，引起造血功能衰竭而發(fā)生的一類(lèi)貧血。針對(duì)再障的發(fā)生與骨髓造血干細(xì)胞損傷、造血微環(huán)境缺陷、免疫性造血抑制等因素有關(guān)[1]，結(jié)合醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)學(xué)、中醫(yī)學(xué)的相關(guān)理論，探討營(yíng)養(yǎng)造血湯劑對(duì)再生障礙性貧血的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、營(yíng)養(yǎng)造血湯劑和主要試劑

近交系BALB/c小鼠90只，8～12周齡，雌雄各半，由大連醫(yī)科大學(xué)提供。營(yíng)養(yǎng)造血湯劑由核苷酸、精氨酸、甘氨酸、維生素C、復(fù)合維生素B、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草、女貞子等組成，按原方比例配方，經(jīng)水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用。促紅細(xì)胞生成素（EPO）試劑盒，美國(guó)R&D systems公司；METHOCULTTM GF M3434培養(yǎng)基，加拿大Stem cell technologies公司；TUNEL試劑盒、Fas與Caspase-3檢測(cè)試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及流程

BALB/c小鼠90只，根據(jù)動(dòng)物藥理學(xué)的藥品劑量（小鼠給藥劑量=成人給藥劑量×388/小鼠體重）和綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)分析，采用完全隨機(jī)數(shù)字表法均分為：①正常對(duì)照組；②再障模型組；③營(yíng)養(yǎng)造血湯劑治療組[以19.76g/（kg·d）對(duì)小鼠灌胃]。苯、X射線、環(huán)磷酰胺三聯(lián)應(yīng)用的方法建立再障小鼠模型[1]。從第8天開(kāi)始，對(duì)治療組小鼠進(jìn)行灌胃，每天1次，直至第60天，頸椎脫臼處死小鼠，采樣進(jìn)行檢測(cè)。

表1 對(duì)照組與再障模型組小鼠外周血的相關(guān)指標(biāo)數(shù)值（±s，n＝30）

表1 對(duì)照組與再障模型組小鼠外周血的相關(guān)指標(biāo)數(shù)值（±s，n＝30）

注：與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）；與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.05）

EPO（pg/mL）46.64±10.06 879.53±90.92* 258.96±59.05**組別對(duì)照組模型組治療組Hb（g/L）164.32±10.74 80.11±13.65* 150.1±14.68** RBC（×1012/L）8.99±1.15 3.35±0.97* 6.53±1.25** WBC（×109/L）8.69±1.68 2.09±1.52* 4.81±0.69** PLT（×109/L）902.36±150.35 470.8±112.09* 807.±100.03**

表2 對(duì)照組與模型組小鼠骨髓的相關(guān)指標(biāo)數(shù)值（±s，n＝30）

表2 對(duì)照組與模型組小鼠骨髓的相關(guān)指標(biāo)數(shù)值（±s，n＝30）

注：與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）；與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.05）

Caspase-3陽(yáng)性率(%) 0.88±0.51** 6.94±0.81 4.39±0.40**組別對(duì)照組模型組治療組BMNC（×106/根股骨）8.50±2.01 1.25±0.54* 6.87±0.58**集落數(shù)（個(gè)/2×106 BMNC）28.00±4.72 5.60±2.13* 23.3±6.2**凋亡率（%）5.23±0.28** 10.03±0.46 7.01±0.24** Fas陽(yáng)性率(%) 14.90±1.78** 26.11±1.60 20.04±0.88**

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)小鼠血紅蛋白含量、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板數(shù)；測(cè)定血清EPO含量。游離股骨，制備骨髓涂片、骨髓細(xì)胞懸液，繼而計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1.5×105/mL，置于METHOCULTTM GF M3434培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后進(jìn)行集落計(jì)數(shù)[2]。5%硝酸溶液浸泡股骨7～12h脫鈣后,常規(guī)病理制片，觀察骨髓增生程度；TUNEL法免疫組化染色程序按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)讀取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

詳見(jiàn)表1～2。

3 討論

研究表明，營(yíng)養(yǎng)造血湯劑對(duì)改善再障小鼠骨髓抑制狀態(tài)有顯著促進(jìn)作用，可進(jìn)一步使造血干/祖細(xì)胞增殖、分化趨于正常，有利于造血支持成分的增生。其中甘氨酸為血紅素的基本原料，利于造血干細(xì)胞增殖。維生素C可防止脂質(zhì)過(guò)氧化，穩(wěn)定正常組織中DNA分子，刺激造血祖細(xì)胞，促進(jìn)集落形成[3]。B族維生素可提高細(xì)胞內(nèi)微體的抗氧化防御能力，以改善骨髓造血微環(huán)境，有利于基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。核苷酸堿基的氮氧原子能夠捕獲氧化過(guò)程中形成的自由基，減少由脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞膜及各種DNA的損傷，且具有維持免疫系統(tǒng)的正常功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫能力。精氨酸與賴(lài)氨酸有利于造血干細(xì)胞的基因復(fù)制，有利于EPO的分泌，刺激骨髓造血。

甘草酸是甘草的主要成分，可阻止Fas抗體介導(dǎo)的造血干細(xì)胞凋亡，有助于骨髓造血功能恢復(fù)。當(dāng)歸對(duì)造血細(xì)胞增殖、分化有顯著刺激作用[4]，能降低再障小鼠骨髓細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增生。女貞子可提升外周白細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬作用，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用。營(yíng)養(yǎng)造血湯劑可減少骨髓造血細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善骨髓造血功能，明顯改善外周血象三系減低的狀況，對(duì)治療再生障礙性貧血安全有效，對(duì)臨床應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)造血湯劑治療再障提供了試驗(yàn)依據(jù)。

[1]于敬達(dá),李得春.苯、X射線、環(huán)磷酰胺聯(lián)合復(fù)制小鼠再障模型實(shí)驗(yàn)研究[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（6）：25-27.

[2]Miller CL，Rebel VI，Lemieux ME，et al.Studies of W mutant mice provide evidence for alternate mechanisms capable of activating hematopoietic stem cells[J].Exp Hematol，1996，24（2）：185-194.

[3]Snyder R.Recent developments in the understanding of benzene toxicity and leukemogenesis[J].Drug Chem Toxicol，2000，23（1）：13-25.

[4]劉玉蘭，孟慶勇.當(dāng)歸注射液對(duì)輻射損傷小鼠免疫功能的作用[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，20（5）：334-335.