向進(jìn)樂(lè)，李志西，郭香鳳，李 歡，鄭淑彥

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定枳椇果梗多酚含量

向進(jìn)樂(lè)1,2，李志西1,*，郭香鳳2，李 歡1，鄭淑彥1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

以沒(méi)食子酸為標(biāo)樣，研究Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定枳椇果梗總酚含量的適宜條件。結(jié)果表明，枳椇果梗提取物加Folin-Ciocalteu試劑0.6mL、20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，定容至10mL，30℃避光反應(yīng)60min，測(cè)定反應(yīng)體系在750nm處的吸光度，多酚質(zhì)量濃度在0～8.47mg/L范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度以及加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求，可用于枳椇果梗多酚含量的測(cè)定。

Folin-Ciocalteu法；枳椇果梗；多酚

枳椇為鼠李科枳椇屬(Hovenia thunb)植物，又稱拐棗、雞柤子、半甜夜。全世界有三個(gè)種，兩個(gè)變種。我國(guó)除東北三省、內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、青海和臺(tái)灣外，其余各省區(qū)均有分布。枳椇屬植物始載于《唐本草》，以果實(shí)、木汁、木皮入藥，現(xiàn)由《中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥材》收載[1]。枳椇屬植物多以枳椇子入藥，即枳椇干燥成熟的種子，關(guān)于枳椇子生物活性成分和生理功能及其作用機(jī)制等方面已有諸多報(bào)道[1-2]。而關(guān)于肉質(zhì)肥大扭曲、酸甜的枳椇果梗的研究開(kāi)發(fā)鮮見(jiàn)報(bào)道，這可能與其個(gè)體小、外形扭曲、殘?jiān)?、適口性差有關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的枳椇果梗初級(jí)加工制品有枳椇果汁飲料[3-6]、果酒[7]、果醋[8]和酸乳[9]等產(chǎn)品。本課題組[10]以枳椇果梗為原料，采用液態(tài)深層發(fā)酵法釀制出風(fēng)味獨(dú)特的枳椇果梗酒、果醋，并對(duì)枳椇醋的保健功能進(jìn)行初步研究。發(fā)現(xiàn)枳椇醋具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用、良好的減肥降脂作用，對(duì)急性酒精中毒以及由酒精引起的慢性肝損傷也有很好的預(yù)防作用。鄒禮根等[11]也發(fā)現(xiàn)枳椇果梗水提物具有一定的解酒效果。

對(duì)枳椇果梗的化學(xué)成分研究也有少量報(bào)道。符樹(shù)根[3]、江慶中[4]等對(duì)枳椇果梗和種子質(zhì)量所占比例和基本化學(xué)組成進(jìn)行研究，枳椇果梗約占總質(zhì)量的90%，兩者基本化學(xué)組成差異很大。鮮果梗中含有大量糖分、有機(jī)酸、氨基酸和維生素等，其中總糖含量35.13%、還原糖17.23%、總酸390mg/100g、VC 44mg/100g。賈春曉等[12]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographymass spectrometry，GC-MS)對(duì)枳椇果梗中有機(jī)酸進(jìn)行分析，鑒定出19種有機(jī)酸，其中蘋果酸的含量最高，占22.88%；枳椇果梗還含有多種不飽和高級(jí)脂肪酸，其中亞麻酸和亞油酸含量分別為5.06%和3.35%。朱炯波等[13]采用蒽酮硫酸比色法對(duì)枳椇果梗多糖含量進(jìn)行分析，枳椇果梗中多糖為13.83%。Yoo等[14]以枳椇果實(shí)為原料通過(guò)水提、有機(jī)溶劑萃取和低壓制備色譜技術(shù)分離制備出高純度的二氫楊梅素。

多酚是植物原料的一種重要次生代謝產(chǎn)物，是絕大多數(shù)植物性食品和藥材的活性成分。枳椇果中含有二氫楊梅素等酚類物質(zhì)[14-15]，但枳椇果梗多酚含量測(cè)定的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。植物多酚含量測(cè)定方法較多，包括滴定法、比色法等[16]。Folin-Ciocalteu比色法是Folin-Denis的改進(jìn)，是目前測(cè)定植物多酚含量的最常用方法，但目前報(bào)道的不同原料多酚含量測(cè)定條件，如檢測(cè)波長(zhǎng)、Folin-Ciocalteu試劑用量、堿液加入量以及顯色溫度和時(shí)間等都有較大差異[16-17]。本研究擬建立Folin-Ciocalteu法測(cè)定枳椇果梗多酚含量的適宜條件，以期為枳椇果的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇果 采自西安市臨潼區(qū)龍河西岸南姚村；沒(méi)食子酸(純度≥98%) 成都曼斯特生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司；甲醇、Na2CO3等常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550雙光束紫外分光光度計(jì)、UVmini 1240單孔紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；KH5200B超聲清洗機(jī) 昆山禾創(chuàng)超聲設(shè)備有限公司；電子天平 北京塞多利斯天平有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；移液器上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液與樣品溶液的制備

對(duì)照品溶液配制：精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品12.1mg加甲醇溶解定容至100mL，得質(zhì)量濃度121mg/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

枳椇果梗多酚溶液的制備：參考呂群金等[18]的方法略有改動(dòng)。稱取干燥的枳椇果梗粉末1.0g加入40mL 70%甲醇溶液，40℃超聲提取30min，過(guò)濾得濾液。濾渣加入30mL 70%甲醇溶液重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓濃縮定容至25mL作為枳椇果梗多酚樣品溶液。

1.3.2 Folin-Ciocalteu法比色條件的選擇

1.3.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選取[16]

取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和枳椇果梗樣品溶液各0.1mL，分別加蒸餾水稀釋，加0.5mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入1.5mL 20g/100mL Na2CO3溶液，加水定容至10mL，室溫避光反應(yīng)120min，以空白為對(duì)照，在500～900nm范圍內(nèi)掃描確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2.2 顯色溫度和時(shí)間的確定[17]

分別取對(duì)照品溶液和枳椇果梗樣品溶液0.25mL于25mL容量瓶中，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu試劑1.25mL混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液3.75mL，加水定容，將各比色試劑混合均勻后，分別于25、30、35、40、45℃條件下水浴避光反應(yīng)，分別于30、60、90、120、150min時(shí)測(cè)定吸光度，以考察反應(yīng)溫度和顯色時(shí)間對(duì)顯色效果的影響。

1.3.2.3 Folin-Ciocalteu試劑和Na2CO3溶液加入量[17]

取枳椇果梗樣品溶液0.1mL，加水稀釋，分別加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min，考察Folin-Ciocalteu試劑用量對(duì)吸光度的影響。

取枳椇果梗樣品溶液0.1mL，加水稀釋，分別加入0.6mL的Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后按1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5的比例加入20g/100mL Na2CO3溶液，30℃避光反應(yīng)60min，考察Folin-Ciocalteu試劑與Na2CO3溶液比例對(duì)吸光度的影響。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]

精密吸取1、2、3、4、5、6、7mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋定容于10mL棕色容量瓶得不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1mL不同濃度的對(duì)照品溶液加水稀釋，加入0.6mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min，以蒸餾水代替樣品為空白，在750nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。枳椇果梗多酚含量以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)。

1.3.4 Folin-Ciocalteu法測(cè)定枳椇果梗多酚的方法學(xué)評(píng)價(jià)[16]

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一枳椇果梗樣品溶液按確定的測(cè)定條件，分別在樣品液與顯色劑反應(yīng)60、90、120、150、180、210min后的不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定吸光度，以評(píng)價(jià)該方法在一段時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：取干燥的枳椇果梗粉末樣品5份，依上述樣品溶液制備和分析方法，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性。

精密度實(shí)驗(yàn)：采用確定的測(cè)定方法對(duì)同一枳椇果梗提取液測(cè)定5次，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該方法的精密度。

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：取已知多酚含量的枳椇果梗樣品5份，分別加入不同量的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別測(cè)定混合樣品顯色后的吸光度，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法檢測(cè)條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

多酚物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)顯色是基于Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸將多酚化合物定量氧化，自身被還原(使W6+變?yōu)閃5+)生成藍(lán)色的化合物，在680～780nm有較大吸收[16-22]。沒(méi)食子酸對(duì)照品、枳椇果梗提取物與Folin-Ciocalteu顯色后的光譜圖如圖1所示，兩者均在750nm左右有最大吸收，故選750nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)照品(a)和枳椇果梗提取物(b)顯色后的光譜圖Fig.1 Visible absorption spectra of Folin-Ciocalteu reagent in the presence of gallic acid (a) or of Hovenia acerba fruit extract (b)

2.1.2 顯色溫度和時(shí)間的確定

圖2 沒(méi)食子酸對(duì)照品不同顯色溫度和時(shí)間的吸光度Fig.2 Absorbance of reaction products between gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent at different reaction time points and temperatures

多酚物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)需要一定溫度和反應(yīng)時(shí)間才能顯色完全。從圖2可知，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度條件下顯色，達(dá)到最大吸光度的時(shí)間有較大差異。溫度越高達(dá)到最大吸光度的時(shí)間越短。35～45℃時(shí)，顯色30min吸光度就達(dá)到最大，30min后吸光度下降明顯。說(shuō)明溫度高能加快顯色進(jìn)程，但是顯色體系的穩(wěn)定性較差。25～30℃顯色，反應(yīng)30min吸光度達(dá)到較大值，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度增加，60～120min達(dá)到最大值，顯色體系穩(wěn)定性很好。但在25℃，吸光度偏低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。

圖3 枳椇樣品不同顯色溫度和時(shí)間的吸光度Fig.3 Absorbance of reaction products between Hovenia acerba fruit extract and Folin-Ciocalteu reagent at different reaction time points and temperatures

圖3為不同顯色溫度和時(shí)間條件下，枳椇果梗樣品溶液顯色后的吸光度的變化?？梢钥闯觯瑴囟鹊?，反應(yīng)慢，吸光度??；溫度高，反應(yīng)快，達(dá)到最大吸光度的時(shí)間短，但是反應(yīng)體系很不穩(wěn)定，而且，溫度越高，越不穩(wěn)定。30℃時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度升高，在60～120min處于最大值。因此，確定Folin-Ciocalteu法測(cè)定枳椇多酚含量的顯色溫度為30℃，顯色時(shí)間為60min。

比較圖2、3發(fā)現(xiàn)，枳椇果梗樣品與沒(méi)食子酸對(duì)照品在不同溫度和時(shí)間后顯色結(jié)果有相同的趨勢(shì)。故在其他顯色條件的確定中，只以枳椇果梗樣品溶液為研究對(duì)象。

2.1.3 Folin-Ciocalteu顯色劑和Na2CO3加入量

圖4 Folin-Ciocalteu試劑加入量對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of Folin-Ciocalteu reagent amount on the absorbance of reaction products at 750 nm

由圖4可以看出，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑用量在0.3～0.6mL內(nèi)，隨著顯色劑用量的增加，測(cè)得的吸光度增加，當(dāng)顯色劑的用量超過(guò)0.6mL后，吸光度的變化不明顯。因此，選擇Folin-Ciocalteu試劑加入量為0.6mL。

Folin-Ciocalteu試劑與酚類化合物反應(yīng)的必須在堿性條件下才可以顯色，反應(yīng)體系中Na2CO3溶液是顯色的支持介質(zhì)。Na2CO3溶液與Folin-Ciocalteu試劑的比例會(huì)影響體系的顯色效果[17]。由圖5可以看出，當(dāng)Na2CO3溶液用量增加時(shí)，吸光度升高，當(dāng)Na2CO3溶液與Folin-Ciocalteu試劑比例增加到2.5∶1時(shí)，吸光度最大。但進(jìn)一步增加Na2CO3溶液吸光度反而降低，說(shuō)明體系中堿液的用量不宜過(guò)大。可能是堿性過(guò)強(qiáng)，顯色體系不穩(wěn)定造成吸光度的降低。因此，確定Folin-Ciocalteu試劑與20g/100mL的Na2CO3溶液的體積比為1∶2.5。

圖5 Na2CO3與Folin-Ciocalteu的體積倍數(shù)對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effect of sodium carbonate amount on the absorbance of reaction products at 750 nm

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照確定的檢測(cè)條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.1192χ＋0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0～8.47mg/L范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 Folin-Ciocalteu法測(cè)定枳椇果梗多酚方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一樣品在不同時(shí)間的吸光度見(jiàn)表1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.55%。說(shuō)明該方法在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定樣品吸光度Table 1 Stability test for the optimized Folin-Ciocalteu method

2.2.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

表2 5份樣品測(cè)得的多酚含量Table 2 Repeatability test for the optimized Folin-Ciocalteu method

稱取5份枳椇果梗樣品測(cè)得多酚含量如表2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.95%。說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

同一樣品測(cè)定5次，吸光度分別為0.676、0.673、0.657、0.671、0.665。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%，說(shuō)明該方法具有較高的精密，能滿足枳椇果梗多酚測(cè)定。

2.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定枳椇果梗多酚進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表3。5次加標(biāo)回收最高回收率為101.9%，最低為96.3%，平均為99.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.22%。說(shuō)明Folin-Ciocalteu法測(cè)定枳椇果梗多酚含量具有一定的可靠性。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Spike recovery test for the optimized Folin-Ciocalteu method

3 結(jié)論與討論

Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定枳椇果梗中總酚含量的適宜條件為枳椇果梗提取液加Folin-Ciocalteu試劑0.6mL、20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min后在750nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定枳椇果梗中總酚在前人研究[17-22]的基礎(chǔ)上有所該改進(jìn)。該方法縮短了顯色反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、精密度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。Folin-Ciocalteu比色法能夠用于枳椇果梗多酚含量的測(cè)定。

枳椇果梗除具有高糖分以及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，多酚物含量也較高，枳椇果梗具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得多酚含量為1.38%，多酚物質(zhì)可能是枳椇果梗及其加工制品的主要生理活性物質(zhì)之一，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照發(fā)現(xiàn)枳椇果梗提取物中含有二氫楊梅素、沒(méi)食子酸等酚類物質(zhì)。

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Folin-Ciocalteu colorimetric Determination of Total Polyphenol Content in Hovenia acerba Fruit

XIANG Jin-le1,2，LI Zhi-xi1,*，GUO Xiang-feng2，LI-Huan1，ZHENG Shu-yan1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

A quantitative Folin-Ciocalteu colorimetry method to determine total polyphenols in Hovenia acerba fruit was developed. The color reaction was carried out with 0.6 mL of Folin-Ciocalteu reagent and 1.5 mL of 20 g/100 mL aqueous Na2CO3 solution in darkness at 30 ℃ for 60 min. The detection wavelength was set as 750 nm. The linear range of the established standard curve was 0-8.47 mg/L. The relative standard deviations of stability, reproducibility, precision, and spike recovery rate of this method were all satisfactory. Thus, this method can be applicable to determine the total polyphenols of Hovenia acerba fruit.

Folin-Ciocalteu colorimetry；Hovenia acerba fruit；polyphenol

TS207.3

A

1002-6630(2011)14-0210-05

2010-10-25

國(guó)家級(jí)大學(xué)生科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目(091071202)

向進(jìn)樂(lè)(1980—)，男，講師，博士研究生，主要從事植物活性成分研究。E-mail：xiangjinlexinong@163.com*

李志西(1958—)，男，教授，博士，主要從事發(fā)酵功能食品研究。E-mail：lizhxi@nwsuaf.edu.cn