楊 麗，楊文軍，劉 霞，杜先鋒*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

由馬鈴薯淀粉制得磷酸寡糖的定性定量測定

楊 麗，楊文軍，劉 霞，杜先鋒*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

對以馬鈴薯淀粉為原料、全酶法制得的磷酸寡糖進(jìn)行定性定量分析。通過采用薄層層析法(thin layer chromatography，TLC)和高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(high-performance anionic exchange chromatography-air pulsing ampere detectors，HPAEC-PAD)對磷酸寡糖組分進(jìn)行檢測分析，同時利用紅外吸收光譜(infrared spectroscopy，IR)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：磷酸寡糖是結(jié)合有磷酸基團(tuán)的并且聚合度在3～7之間的麥芽低聚糖混合物，以麥芽三糖至麥芽六糖組分居多。

磷酸寡糖；薄層層析法；高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測；紅外吸收光譜

寡糖又稱低聚糖的概念是Helgerich于1930年首先提出的[1]。它們通常指由2～10個單糖通過糖苷鍵連接形成的具有直鏈或支鏈的低度聚合糖類，一般以還原端的糖命名，如麥芽寡糖、寡果糖、寡木糖、纖維寡糖等[2]。根據(jù)寡糖的生物學(xué)功能可將其分為功能性寡糖和普通寡糖兩大類。功能性寡糖通常不被胃酸及人體酶所水解，不能被人體腸道所利用。與一般的低聚糖相比，功能性低聚糖具有如促進(jìn)雙歧桿菌增殖、抑制體內(nèi)毒素生成，調(diào)節(jié)腸胃功能、抗衰老、防止膽固醇積累、降低血壓等獨(dú)特的生理功能，是功能性食品開發(fā)和研究的重點(diǎn)[3-5]。

磷酸寡糖(phosphoryl oligosaccharides，POs)是指從馬鈴薯淀粉水解產(chǎn)物中分離得到的分子中帶有磷酸酯鍵(C—O—P)，且聚合度在3～6之間的麥芽寡糖的混合物。其具有促進(jìn)體內(nèi)鈣、鐵等礦物質(zhì)吸收和溶解、抗齲齒、抗淀粉老化等獨(dú)特的功能特性。此外，將磷酸寡糖可添加到液體或粉末狀肥料及藥劑中，還可起到保持植物如水果和切花的保質(zhì)期的作用，是應(yīng)用安全、廣泛的新型功能性低聚糖[6]。磷酸寡糖的概念最早是由日本學(xué)者Kamasaka等于1995年提出的，目前日本已有磷酸寡糖的商業(yè)化產(chǎn)品問市[7]，而我國對其重視較晚，當(dāng)前對其生產(chǎn)制備研究尚屬空白，因此，完善制備磷酸寡糖的相關(guān)理論研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

磷酸寡糖是從天然的馬鈴薯淀粉水解液中分離出來的，具有含量低、成分復(fù)雜、純化難度大的特點(diǎn)，給磷酸寡糖的定性定量分析帶來了一定的難度。由于目前未有磷酸寡糖標(biāo)準(zhǔn)品面市，所以無法直接對其進(jìn)行定性定量分析，只能采用堿性磷酸酯酶對磷酸寡糖進(jìn)行脫磷酸根處理之后，使其轉(zhuǎn)化為麥芽低聚糖，與麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，采用低聚糖類通用的分析和檢測方法對其進(jìn)行分析測定。利用薄層層析法和高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測器(high-performance anionic exchange chromatography-air pulsing ampere detectors，HPAEC-PAD)對其進(jìn)行組分分析，同時采用紅外吸收光譜(infrared spectroscopy，IR)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步探討磷酸寡糖的功能、制備及研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸寡糖樣品(以馬鈴薯淀粉為原料制備方法參見文獻(xiàn)[8]) 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)磷酸寡糖課題組；色譜級葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000高效陰離子交換色譜儀(脈沖安培檢測器)美國Dionex公司；NEXUS-870傅里葉紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 磷酸寡糖的薄層層析[9-10]

將高效薄層層析硅膠板置于110℃干燥箱內(nèi)活化30min，保證膠板干燥，之后使用夾子輕輕夾出，即可點(diǎn)樣使用。以葡萄糖、麥芽低聚糖(DP2～7)做為標(biāo)準(zhǔn)品，磷酸寡糖做為樣液，質(zhì)量濃度為0.4g/100mL，點(diǎn)樣量為2μL。于活化后的硅膠板上點(diǎn)樣，吹干后放入經(jīng)展開劑飽和的層析缸中展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)距膠版上端大約1cm處，停止展開。取出硅膠板，用吹風(fēng)機(jī)吹干，噴顯色劑于硅膠板上，并在110℃條件下加熱10min使其充分顯色，觀察分離效果。根據(jù)斑點(diǎn)的顏色和面積粗略判斷各組分糖的含量。

1.3.2 磷酸寡糖的結(jié)構(gòu)分析[11]

紅外吸收光譜分析依據(jù)的信息主要是分子內(nèi)部原子間的相對振動(分子振動)，以及分子轉(zhuǎn)動的特征信息。在化合物紅外光譜圖上，吸收峰越大，說明化合物對這區(qū)域光吸收越強(qiáng)。而對每一個化合物來說，在哪些波數(shù)可產(chǎn)生吸收峰是與其化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是官能團(tuán)密切相關(guān)的[12]。通過化合物的紅外光譜圖，確定含哪些官能團(tuán)，進(jìn)一步確定化學(xué)結(jié)構(gòu)。

取凍干的磷酸寡糖樣品，通過溴化鉀壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。通過紅外光譜圖中糖類物質(zhì)和磷酯鍵的特征吸收峰，對磷酸寡糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.3 磷酸寡糖的組分分析

1.3.3.1 磷酸寡糖的脫磷處理[13]

由于磷酸寡糖分子中結(jié)合有磷酸基團(tuán)，影響磷酸寡糖的定性分析，因此，在進(jìn)行組分分析前需將磷酸基團(tuán)除去。使用堿性磷酸酯酶在一定條件下，可以水解磷酸寡糖上的酯鍵，條件溫和，糖不被破壞。

酶切條件：磷酸寡糖粗品400μL，含有10mmol/L MgCl2的Tris-HCl緩沖液(pH9.0) 90μL，0.4U/μL的堿性磷酸酯酶10μL，37℃條件下反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束后置于超濾離心管(3kD)中，6000r/min離心20min，去除堿性磷酸酯酶。

1.3.3.2 高效陰離子交換色譜定性分析磷酸寡糖[14-16]

標(biāo)準(zhǔn)品配制：G1～G7標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，用超純水分別溶解定容至10mL，配制成1mg/mL的儲備液。分別吸取G1～G7的儲備液0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mL定容至10mL配制成麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。經(jīng)用0.22μm的水系濾膜過濾后進(jìn)樣。

樣品檢測：取制備的磷酸寡糖粗品，用去離子水稀釋至10μg/mL，經(jīng)0.22μm水系濾膜過濾后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸寡糖薄層層析

2.1.1 展開劑的選擇

分別采用以下展開劑：乙酸乙酯-吡啶-水(5:20:7)、乙酸乙酯-甲醇-水-氨水(5:9:1:1.5)、正丁醇-乙酸-水(3:1:1)3種對磷酸寡糖進(jìn)行展開，點(diǎn)樣量為2μL，均以苯胺-二苯胺-磷酸為顯色劑比較不同展開劑對磷酸寡糖的層析效果。3種展開劑對磷酸寡糖的層析結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，展開劑Ⅱ展開效果最佳，展開劑Ⅰ、Ⅲ均不能將糖樣充分展開，因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選正丁醇-乙酸-水做為磷酸寡糖中糖組分的薄層鑒定展開劑。

表1 不同展開劑對磷酸寡糖的展開效果對照表Table 1 Comparison of separation results of phosphorylated sligosaccharides with different developing solvents

2.1.2 顯色劑的選擇

通過除蛋白前后香水蓮花多糖溶液蛋白質(zhì)和多糖含量的測定,比較3種方法的除蛋白效果。如圖3,TCA法蛋白質(zhì)清除效果最佳,可達(dá)70.49%,多糖損失率最少為29.24%,該方法結(jié)果穩(wěn)定,操作簡單,能夠在除蛋白的過程中更好的保證多糖的活性; TCA-Sevage法次之; Sevage法除蛋白僅為14.31%,而多糖損失率最高,相較于其他2種方法,該方法雖然條件溫和,可以減少多糖的降解,但需要消耗大量有機(jī)試劑,操作繁瑣,效率低,難以清除與多糖緊密結(jié)合或被多糖包裹的蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)選擇了兩種顯色劑，分別是顯色劑Ⅰ(苯胺-二苯胺-磷酸)和顯色劑Ⅱ(10%硫酸-乙醇溶液)，比照層析譜圖效果確定最佳顯色劑。結(jié)果顯示，以10%硫酸-乙醇溶液顯色背景干擾大，對磷酸寡糖顯色效果較差，樣斑為黑色或棕色，原因可能是硫酸的存在使糖樣炭化所致。而苯胺-二苯胺-磷酸顯色靈敏度好，背景干擾小，樣斑清晰呈淺紫色。所以優(yōu)選苯胺-二苯胺-磷酸做為實(shí)驗(yàn)中的最佳顯色劑。

2.1.3 磷酸寡糖的薄層層析

將標(biāo)準(zhǔn)品(G1～G7)和磷酸寡糖樣品于同一硅膠板上進(jìn)行薄層層析分析，展開顯色后結(jié)果如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及磷酸寡糖的薄層層析圖Fig.1 Thin layer chromatographic patterns of phosphorylated sligosaccharide standard and sample

由圖1可以看出，各樣點(diǎn)在硅膠板上展開和顯色效果相對較好，斑點(diǎn)清晰呈淺紫色，背景干擾小。標(biāo)樣和1、2樣點(diǎn)中G6、G7兩點(diǎn)沒有展開，可能是由于糖分子質(zhì)量太大，展開劑極性不夠大；1、2樣譜帶中其各個顯色點(diǎn)對應(yīng)于標(biāo)樣均顯滯后，可能是由于其結(jié)合磷酸根使分子質(zhì)量增大的緣故。其中麥芽三糖至麥芽六糖斑點(diǎn)面積大、顏色深，說明馬鈴薯淀粉中磷酸寡糖的糖組分主要為麥芽三糖至麥芽六糖。由此可以推斷出實(shí)驗(yàn)所制備的磷酸寡糖樣品是含有結(jié)合有磷酸根的G2～G7這幾種糖組分。

2.2 磷酸寡糖的結(jié)構(gòu)分析

圖2 磷酸寡糖紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of phosphorylated oligosaccharide sample

將冷凍干燥得到的粉末狀磷酸寡糖樣品進(jìn)行紅外光譜溴化鉀壓片法分析。當(dāng)樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時，分子吸收了某些頻率的輻射，引起偶極矩的凈變化，能級從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，而相應(yīng)于這些吸收區(qū)域的透射光強(qiáng)度減弱。記錄波數(shù)或波長與紅外光的百分透射比關(guān)系的曲線，得到圖2所示的紅外光譜圖。

根據(jù)紅外光譜圖(圖2)分析表明：在3000～2800cm-1區(qū)域內(nèi)有糖類物質(zhì)的特征吸收峰，2930cm-1是次甲基(—CH2—)中C—H伸縮振動的吸收峰，1420cm-1處是羰基的C=O伸縮振動引起的吸收峰，764cm-1處是D-葡萄吡喃糖環(huán)C—O—C振動吸收峰。1080cm-1處有P—O—C基團(tuán)的伸縮振動吸收峰，930cm-1處有五價(jià)磷的P—O伸展振動。由此，可進(jìn)一步確定磷酸寡糖為結(jié)合有磷酸基團(tuán)的麥芽低聚糖混合物。

2.3 HPAEC-PAD分析磷酸寡糖的組分

根據(jù)1.3.3節(jié)方法將麥警芽低聚標(biāo)準(zhǔn)品、未脫磷的磷酸寡糖樣品(POS)、脫磷的磷酸寡糖樣品(de-POS)分別進(jìn)行HPAEC-PAD色譜分析，結(jié)果見圖3～5所示。

圖3 麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品HPAEC-PAD色譜圖Fig.3 HPAEC-PAD chromatography of authentic maltooligosaccharides

由圖3可以看出，采用CarboPac PA-200(3mm× 250mm)分析柱，100mmol/L氫氧化鈉和1mol/L乙酸鈉溶液梯度洗脫，可將低聚糖很好的分離開來，G1～G7在4～65min之間依次出峰。

圖4 磷酸寡糖樣品HPAEC-PAD色譜圖Fig.4 HPAEC chromatography of phosphorylated oligosaccharide samples

由圖4可知，由于磷酸寡糖分子中葡萄糖殘基上結(jié)合有磷酸基團(tuán)，帶有負(fù)電荷，因此，相對于中性糖，它的出峰時間向后延遲。可以看出，在85～95min之間有系列特征峰出現(xiàn)，而在4～65min之間沒有麥芽低聚糖特征峰出現(xiàn)，因此，推斷該系列特征峰為磷酸寡糖。

圖5 脫磷的磷酸寡糖樣品HPAEC-PAD色譜圖Fig.5 HPAEC chromatography of dephosphorylated oligosaccharide sample

從圖5可以看出，在85～95min之間沒有如圖3中所出現(xiàn)的系列峰，說明脫磷酸基團(tuán)后破壞了該物質(zhì)的存在，且與圖3對比發(fā)現(xiàn)，在4～65min之間出現(xiàn)了麥芽低聚糖特征峰，包含G1～G7。通過表2對比麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與de-POS的保留時間，可以看出各組分的保留時間誤差均在1min以內(nèi)，相對誤差小于1.9%。由此可以判定本實(shí)驗(yàn)中制備得到的磷酸寡糖為聚合度在3～7之間的麥芽低聚糖混合物。價(jià)磷的P—O伸展振動。由此判定本實(shí)驗(yàn)所制備的樣品為結(jié)合有磷酸基團(tuán)的麥芽低聚糖混合物——磷酸寡糖。3.3 由于磷酸寡糖是一種新型功能性低聚糖，且是一種混合物，目前市場上尚未見磷酸寡糖的標(biāo)準(zhǔn)品銷售，直接對磷酸寡糖進(jìn)行相關(guān)的定性定量分析存在一定困難。因此，實(shí)驗(yàn)中只能以麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用HPAEC-PAD法對磷酸寡糖進(jìn)行組分分析。由于分子中磷酸基團(tuán)的作用，磷酸寡糖的保留時間延長，出峰時間向后延遲，對比脫磷后的磷酸寡糖與麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，確定其主要組分為麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖。

表2 de-POS與麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照表Table 2 Retention times of authentic maltooligosaccarides and dephosphorylated oligosaccharides

3 結(jié) 論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用展開劑正丁醇-乙酸-水(3:1:1)，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸，點(diǎn)樣量為2μL，點(diǎn)樣原點(diǎn)直徑小于2mm時，各樣點(diǎn)在硅膠板上展開和顯色效果相對較好，可將麥芽糖至麥芽七糖各組分分開，通過與麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品對照，可以推斷出磷酸寡糖含有結(jié)合有磷酸根的G2～G7這幾種糖組分。

3.2 紅外光譜溴化鉀壓片法結(jié)果表明：樣品在1080cm-1處有P—O—C基團(tuán)的伸縮振動吸收峰，928cm-1處有五

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Determination of Phosphorylated Oligosaccharides Prepared from Potato Starch

YANG Li，YANG Wen-jun，LIU Xia，DU Xian-feng*
(College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

The current study was carried out to quantitatively and qualitatively analyze phosphorylated sligosaccharides prepared from potato starch by totally enzymatic method. The phosphorylated sligosaccharide composition was determined by thin layer chromatography (TLC) and high performance anionic exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Infrared spectroscopy (IR) was used for structure elucidation. The analytes were identified as a mixture of maltooligosaccharides containing phosphate groups and having a degree of polymerization between 3 and 7, in which maltotriose, maltotetraose, maltopentaose and maltohexaose were the dominant components.

phosphorylated oligosaccharides；thin layer chromatography (TLC)；high-performance anionic exchange chromatography-air pulsing ampere detectors (HPAEC-PAD)；infrared spectroscopy (IR)

TQ917

A

1002-6630(2011)14-0198-04

2010-09-30

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z340)

楊麗(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及農(nóng)副產(chǎn)品深加工。E-mail：yangli5960@126.com

*通信作者：杜先鋒(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物及農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dxf@ahau.edu.cn