張小飄綜述,聶 明審校

(湖北省襄樊市第一人民醫(yī)院檢驗科 441000）

酶聯(lián)免疫斑點(enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT)檢測技術結合了細胞培養(yǎng)技術與酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術的長處,能夠分析經特異抗原活化后分泌細胞因子[如干擾素-γ(interferongamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等]的單個效應細胞的頻數(shù),具有敏感、特異、易于重復的優(yōu)點[1],是檢測抗原反應性效應細胞的最可靠實驗方法之一[2],目前已成為抗原特異性T細胞免疫學研究的主流技術。本文就ELISPOT技術作如下綜述。

1 ELISPOT技術的基本原理

ELISPOT培養(yǎng)板以二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜等為基質,包被上特異性單克隆抗體,在培養(yǎng)板孔內加入細胞培養(yǎng)基、待檢測的細胞及抗原刺激物進行培養(yǎng)。在特異性抗原或非特異性有絲分裂原的刺激下,T細胞分泌各種細胞因子,細胞因子被膜上的單克隆抗體捕獲。被捕獲的細胞因子可以與生物素標記的第二抗體結合,然后用酶標親和素與生物素進行化學酶聯(lián)顯色,在膜的局部形成一個個圓形斑點[3]。

2 ELISPOT技術的優(yōu)點

ELISPOT技術得到廣泛應用,首先是由于其在檢測抗原特異性細胞低頻數(shù)時的高敏感性,比以流式細胞術為基礎的技術(四聚體和細胞內細胞因子染色)的敏感性要高1～2個數(shù)量級;其次,ELISPOT技術可以利用凍存的外周血單個核細胞(peripheral b lood mononuclear cells,PBMC)樣本來進行免疫監(jiān)測分析而不喪失細胞的重要活性[4],同時計算機輔助圖像分析系統(tǒng)的使用也使大規(guī)模研究成為可能。

3 ELISPOT技術的分析方法

由于IFN-γ分泌量較多,且與T細胞的細胞毒功能密切相關,使IFN-γ的ELISPOT技術分析得到了廣泛應用[5]。但是,單獨檢測IFN-γ不足以充分反映T細胞的免疫功能,同時檢測多種細胞因子的需求使雙色ELISPOT、熒光ELISPOT及Granzyme B ELISPOT等分析方法相繼出現(xiàn)[6-8]。但這些方法還需進一步完善,雖然早已有雙色ELISPOT技術應用的報道,但一些原因卻限制了其廣泛使用。(1)當ELISPOT板包被時,2種捕獲抗體競爭結合到膜表面,抗體的疏水性決定它們結合到膜上的親活力,如果1種抗體具有更強的親水性,它將喪失競爭力;(2)底物產生的2種顏色必須各自獨立形成,不能相互干擾,且都不能處于優(yōu)勢地位,這樣產生2種細胞因子的細胞才能被檢測出來;(3)圖像分析系統(tǒng)也必須建立起來,并通過驗證能準確客觀地測量每個斑點的顏色和形態(tài);(4)細胞因子的產量還受反饋機制調節(jié)。因此,需要明確哪些細胞因子結合可以在雙色ELISPOT技術中進行檢測。Quast等[9]發(fā)現(xiàn)白介素2(interleukin-2,IL-2)可導致IFN-γ和IL-5斑點的丟失。熒光ELISPOT技術檢測時由于熒光素直接偶聯(lián)在抗體或親和素上,缺乏酶催化底物的放大作用,靈敏度無法與化學顯色的ELISPOT技術方法比較。此外硝酸纖維素膜和PVDF膜有自發(fā)熒光現(xiàn)象,導致背景升高,信噪比下降[10]。

4 ELISPOT技術的標準化與驗證

由于超高的靈敏度,ELISPOT結果易受到諸多因素影響,所以,需要進行ELISPOT技術的標準化與驗證[11]。

4.1 ELISPOT技術的標準化

4.1.1 ELISPOT板 Schielen等[12]首先將PVDF膜應用到ELISPOT技術,后來隨著ELISPOT-免疫沉淀反應(immunop recipitation,IP)及高通量篩選(high-throughput screening,HTS)等板材的應用,質量得到進一步的提高。塑料ELISA板蛋白結合能力有限,所以不建議使用。建議在一項研究中使用同一種板材,最好為同一批次,同時需要檢查生產廠家的質量控制程序,批次性能以及是否達到生物分子篩查協(xié)會(society for biomolecu lar sciences,SBS)制定的標準。

4.1.2 包被規(guī)程 使用PVDF膜板,預濕時每孔加入70%乙醇15μL以降低膜的疏水性。但乙醇必須被充分洗掉,殘留乙醇能干擾斑點形成。成對抗體的選擇根據(jù)實驗要求而定,需要考慮抗體敏感性因素。不同商品試劑盒檢測相同細胞因子的敏感性可相差10倍,所以需要進行標準化,其中的一個重要參數(shù)是包被抗體的總量,一般認為每孔約0.5～1.0μg包被抗體可以得到理想的斑點。

4.1.3 細胞準備 (1)細胞分離:因為紅細胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影響T細胞功能,所以,必需進行PBMC的分離。(2)凍存、貯藏和運輸:凍存在細胞處理過程中最為關鍵。細胞的凍存有多種方法,自動控制降溫器可以提供逐步智能降溫,這在細胞最佳凍存及其標準化程序中是必需的;經濟實用的方法是使用裝有異丙醇的凍存盒。血液樣本處理,分離及凍存的最佳時間范圍應該在8 h內或在采集當天完成,樣本放置時間過長或在不合適的溫度下過久,會影響PBMC的功能,甚至可造成IFN-γ斑點形成細胞減少5倍以上。運輸PBMC的最佳方式是專用的冷凍液氮裝置,液氮緩慢揮發(fā)使氣態(tài)氮充滿運輸容器,使樣本可在接近-140℃的恒定溫度下保持10～18 d。不斷變化的溫度會對細胞功能造成致命影響,不推薦用干冰運輸盒運送標本。(3)細胞復蘇:細胞復蘇時應用DNA酶能提高細胞的產量并降低細胞團塊形成[13],ELISPOT技術分析前最好將PBMC放置過夜,使有凋亡傾向的細胞死亡,這樣在分析前就可以估計出活力細胞的確切計數(shù)[14]。

4.1.4 刺激抗原 重組蛋白可以用來檢測CD4+T細胞介導的反應,對CD8+T細胞介導的反應有限。對重組蛋白的反應依賴于抗原呈遞細胞(antigen-p resenting cell,APC),APC細胞在凍存后數(shù)量減少,同時重組蛋白在不同貯藏溫度下會出現(xiàn)溶解性和穩(wěn)定性的問題?；畹闹亟M病毒載體或病毒感染細胞株也有相似的優(yōu)缺點。重疊多肽池能用來鑒定CD4+和CD8+T細胞識別的最佳表位。肽段越短,重疊越多,鑒別組織相容性復合體(major histocompatibility complex,M HC)-Ⅰ表位時越精確,而不需要考慮可能的MHC-Ⅱ類反應,因為MHC-Ⅱ表位的氨基酸序列長度相對較長。所以檢測 MHC-Ⅰ表位(CD8+T細胞反應)、MHC-Ⅱ表位(CD4+T細胞反應)時在考慮合成肽價格的同時需要找到一個理想的平衡點。另外使用多肽時需要注意多肽的純度,以降低非特異細胞因子的產生。

4.1.5 細胞計數(shù) ELISPOT技術在細胞數(shù)量上需要很高的準確性,同時最小化死細胞數(shù)量也很重要,死細胞可影響分析的正確性。常用臺盼藍排斥試驗和對絲裂原的反應來判斷復蘇后PBMC的質量。但Sm ith等[15]試驗表明檢測細胞的凋亡在判斷細胞活力方面更有效,當?shù)蛲鲂∮?8%時可以得到理想結果。目前已有自動化設備用來進行細胞計數(shù)以及細胞活力檢測。

4.1.6 洗滌及斑點形成 洗滌程序可以采用手工,也可以使用自動洗板機。大批量洗滌時,手工需要很長時間,從而造成孵育時間不一致。另外,手工洗滌時,如果緩沖液過少或壓力過低就不能完全移除細胞和試劑,從而造成膜上的假相斑點增多以及孔的周邊顏料聚集。因此,建議使用自動洗板機,它至少可以使用2種不同的洗滌緩沖液,且能調整清洗探針的高度和緩沖液的流量。斑點的形成與ELISA相似,正確的成對抗體及其濃度必須通過實驗驗證后加以選擇,最佳的抗體量需要參考生產廠家的要求。對于親和素酶復合物也必須給予重視,不同批次間的酶變異性要小,以保證實驗的可比性。底物的選擇能夠影響斑點的檢測數(shù)量,針對同一種酶的不同底物以及不同廠家生產的同一底物可能在敏感性上不同,從而造成斑點計數(shù)產生相當大的差別[16]。

4.1.7 ELISPOT板判讀 使用顯微鏡計數(shù)斑點的方法費時、費力,結果依賴個人經驗,產生偏差和較大變異的問題不可避免。使用自動讀板機可明顯降低計數(shù)時的變異性[17]。Currier等[18]使用自動讀板機時通過23個 8～11肽組成的肽池[雞胚成纖維細胞(chickenembryo fibrob last,CEF)肽池]來確定斑點的參數(shù)設置標準,它們可以被CD8+T細胞識別并被Ⅰ類人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,H LA)-A和H LA-B等位基因呈遞,形成的斑點代表記憶性CD8+T細胞反應。Janetzki等[19]實驗表明使用CEF肽池的控制方法時預設讀板參數(shù)能獲得變異性更小的結果。

4.2 ELISPOT技術的驗證 ELISPOT技術的驗證必須在開始臨床試驗前進行,驗證時應首先確定分析中可能出現(xiàn)問題的變量(如:孵育時間、試劑純度及試劑濃度等),并隨后在國際協(xié)調會議(international conference on harmonisation,ICH)文件ICH-Q2A和ICH-Q2B的指導下對整個操作規(guī)程進行驗證。針對一個標準作業(yè)程序(standard operation procedure,SOP)的驗證過程應該包括:準確性、精確性、特異性、檢出限界、定量限界、線性及檢測范圍。

5 ELISPOT技術的應用展望

ELISPOT技術目前得到了廣泛的應用,其涉及范圍包括:A IDS、癌癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植方面的研究;感染性疾病的免疫監(jiān)測;疫苗的研發(fā)與檢測;免疫顯性表位的鑒定等[20-25]。ELISPOT技術在醫(yī)學研究方面所受的限制不在于技術本身,而在于人們的想象力與創(chuàng)新思維,客觀地說,在一切免疫學研究的前沿領域,ELISPOT技術都是最有力的研究工具之一。

[1] Cox JH,Ferrari G,Janetzki S.Measurement of cytokine re lease at the sing le cell level using the ELISPOT assay[J].Methods,2006,38(4):274-282.

[2] Zhang W,Caspell R,Karu lin AY,et al.ELISPOT assays p rovide rep roducib le resu lts among different laboratories for T-cell immune monitoring--even in hands of ELISPOT-inexperienced investigators[J].J Immunotoxico l,2009,6(4):227-234.

[3] Ka lyuzhny AE.Chem istry and bio logy o f the ELISPOT assay[J].MethodsM ol Biol,2005(302):15-31.

[4] K reher CR,Dittrich M T,Guerkov R,et al.CD4+and CD8+cells in cryopreserved human PBMC maintain full functionality in cytokine ELISPOT assays[J].J Immunol Methods,2003,278(1/2):79-93.

[5] Matijevic M,U rban RG.Use of interferon-gamma ELISPOT in monitoring immune responses in humans[J].Methods Mol Biol,2005(302):237-252.

[6] Shafer-Weaver K,Rosenberg S,Strobl S,etal.Application of the granzyme B ELISPOT assay for monitoring cancer vaccine trials[J].J Immunother,2006,29(3):328-335.

[7] Okamoto Y,Nishida M.Dual-co lor ELISPOT assay for analyzing cytokine balance[J].Methods Mol Biol,2005(302):263-272.

[8] Boulet S,Ndongala ML,Peretz Y,et al.A dual color ELISPOT method for the simu ltaneous detection o f IL-2 and IFN-gamma H IV-specific immune responses[J].J Immunol Methods,2007,320(1/2):18-29.

[9] Quast S,Zhang W,Shive C,et al.IL-2 absorp tion affects IFN-gamma and IL-5,but not IL-4 producing memory T ce lls in doub le co lor cy tokine ELISPOT assays[J].Cell Immunol,2005(237):28-36.

[10]Gazagne A,M alkusch W,V ingert B,et al.Fluorospot assay:methodological analysis[J].M ethods Mol Biol,2005(302):289-296.

[11]Janetzki S,Cox JH,Oden N,et al.Standardization and validation issues of the ELISPOT assay[J].MethodsM ol Biol,2005(302):51-86.

[12]Schielen P,van Rodijnen W,Tekstra J,et al.Quantification of natural antibody producing B cells in rats by an improved ELISPOT technique using the polyviny lidene dif luoridemembrane as the solid support[J].J Immuno l Methods,1995,188(1):33-41.

[13]Sm ith JG,Liu X,Kaufhold RM,et a l.Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation o f cellular immune responses to varicella-zoster virus[J].Clin Diagn Lab Immunol,2001(8):871-879.

[14]Meik lejohn DA,Karlsson RK,Karlsson AC,et al.ELISPOT cell rescue[J].J Immunol M ethods,2004,288(1/2):135-147.

[15]Sm ith JG,Joseph HR,Green T,et al.Estab lishing acceptance criteria for cell-mediated-immunity assays using frozen peripheral b loodmononuclear ce lls stored under optimal and subop timal conditions[J].Clin Vaccine Immunol,2007,14(5):527-537.

[16]Kalyuzhny AE.ELISPOT assay onmembranem icrop lates[J].MethodsMol Biol,2009(536):355-365.

[17]Haw kins N,Self S,W akefield J.The automated counting of spots for the ELISpot assay[J].J Immunol Methods,2006,316(1/2):52-58.

[18]Currier JR,Kuta EG,Turk E,etal.A panelo fM HC class I restricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays[J].J Immuno l Methods,2002,260(1/2):157-172.

[19]Janetzki S,Schaed S,Blachere NE,et al.Evaluation of Elispot assays:in fluence o f method and operator on variability of results[J].J Immunol Methods,2004,291(1/2):175-178.

[20]Shacklett BL,C ritchfield JW,Lemongello D.Quantifying H IV-1-specific CD8(+)T-cell responses using ELISPOT and cytokine flow cytometry[J].MethodsM ol Biol,2009(485):359-374.

[21]Hesseling AC,Gie RP,M andalakas AM.The p redictive value of the ELISpot-based interferon-gamma-release assay for tubercu losis disease[J].Ann Intern Med,2009,150(6):428-429.

[22]Cristaudo A,Bordignon V,Palamara F,et al.Progesterone sensitive Interferon-gamma p roducing cells detected by ELISpot assay in autoimmune progesterone dermatitis[J].Clin Exp Dermato l,2007,32(4):439-441.

[23]Kim SH,Oh EJ,Kim M J,et al.Pretransplant donor-specific interferon-gamma ELISPOT assay p redicts acute rejection episodes in renal transplant recipients[J].Transp lant Proc,2007,39(10):3057-3060.

[24]趙文利,孔祥英,何念海.支氣管哮喘緩解期患兒T輔助細胞功能狀態(tài)評估[J].重慶醫(yī)學,2004,33(8):1211-1213.

[25]Bordignon V,Sinagra JL,T rento E,et al.Antigen specific cy tokine response in pediatric patientsw ith atopic dermatitis[J].Pediatr A llergy Immunol,2005,16(2):113-120.