孫銘飛,廖申權(quán),吳彩艷,戚南山,呂敏娜,袁健豐,于勁術(shù),蔡建平

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室,廣東廣州 510640)

頂復門原蟲與細菌Ⅱ型丙二酰單酰輔
*酶A:ACP轉(zhuǎn)?；秆芯窟M展

孫銘飛,廖申權(quán),吳彩艷,戚南山,呂敏娜,袁健豐,于勁術(shù),蔡建平*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室,廣東廣州 510640)

大部分頂復門原蟲與人畜重要寄生蟲病密切相關(guān)。近年來,由于各類藥物在寄生蟲與細菌病防治中的廣泛應(yīng)用,甚至是濫用,造成了這類寄生蟲與細菌的嚴重抗藥性,急需一些新型抗感染性藥物的出現(xiàn)。由于在一些頂復門原蟲與細菌中廣泛存在的Ⅱ型脂肪酸代謝途徑在其脊椎動物宿主中并不存在,而丙二酰單酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)?；?malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)是由mcat基因編碼的一種巰基酶,負責在起始步驟把丙二?；鶊F從丙二酰單酰CoA上的硫酯連接部位轉(zhuǎn)移到ACP的磷酸泛酰巰基乙胺臂上而形成丙二酰單酰ACP,對于頂復門原蟲和細菌的脂肪酸合成代謝至關(guān)重要,成為研究開發(fā)藥物的理想靶位。文章對ACP轉(zhuǎn)?；傅难芯窟M展進行了綜述。

頂復門原蟲;細菌;丙二酰單酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)酰基酶

*通訊作者

傳統(tǒng)的抗感染特別是抗寄生蟲藥物篩選方法是“化學篩選”,這一篩選方法不僅費時、費力,而且篩選出的藥物,即使在臨床上使用多年,對其抗寄生蟲和抗菌機理仍不清楚,故而當抗藥性出現(xiàn)的時候人們束手無策,無法根據(jù)其藥靶分子的結(jié)構(gòu)特征進行藥物的結(jié)構(gòu)改造來延續(xù)藥物使用[1-6]。上世紀60年代,人們逐步認識到藥靶和藥物相互作用的重要性,開始基于藥靶分子結(jié)構(gòu)進行藥物合理設(shè)計和創(chuàng)制的系統(tǒng)研究。組合化學理論和技術(shù)的出現(xiàn),使人們能根據(jù)對藥靶分子的結(jié)構(gòu)研究,利用化合物庫進行大量篩選。隨著高通量篩選技術(shù)(H TS)的飛速發(fā)展,組合化學技術(shù)與之有機結(jié)合更大大提高了藥物開發(fā)的能力與速度,成為新藥創(chuàng)制研究的重要手段[7-8]。

脂肪酸不僅是所有生物的主要能量來源,而且也是生物膜不可或缺的組成成分[4]?，F(xiàn)已證實,在不同的生物體內(nèi)具有兩種不同的脂肪酸代謝途徑。在人、哺乳動物和禽類的脂肪酸合成酶是被融合成一個多功能的單個多聚肽而存在于胞漿中,這種代謝途徑稱之為Ⅰ型脂肪酸代謝途徑;在細菌和植物,這些酶是獨立的單功能的蛋白,稱之為Ⅱ型脂肪酸代謝途徑[5-6]。

真菌、細菌和頂復門原蟲Ⅱ型脂肪酸合成途徑的催化酶在空間結(jié)構(gòu)和酶學特征上顯著區(qū)別于高等動物的I型脂肪酸合成酶(系),是研究開發(fā)抗這類病原體藥物的理想靶標[8-11]。MCAT作為該代謝途徑中的關(guān)鍵酶,已成為近年來抗菌、抗原蟲及抗真菌藥等研究的焦點問題之一。

丙二酰單酰輔酶 A:ACP轉(zhuǎn)?；?Malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)是由mcat基因編碼的一種巰基酶,在Ⅱ型脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用,負責在起始步驟把丙二酰基團從丙二酰單酰CoA上的硫酯連接部位轉(zhuǎn)移到ACP的磷酸泛酰巰基乙胺臂上而形成丙二酰單酰ACP[1,12]。

丙二酰單酰ACP是脂肪酸代謝過程中的核心物質(zhì),是酮酯酰ACP合成酶(KASI/II/Ⅲ)進行脂肪酸鏈延伸進一步合成脂肪酸的底物[1,12]。此外,最近的研究顯示,MCAT可能還參與多聚酮的生物合成,因此被認為是脂肪酸和多聚酮2個代謝途徑的結(jié)合點[13-15]。早期Harder等人篩選了溫度敏感的大腸埃希菌(Escherichia coli)fabD89突變株,在Ecmcat基因上存在一個琥珀突變[16],在溫度高于39℃時Ecmcat基因停止表達,致使E.coli不能正常合成生長所必需的脂肪酸,使其不能在無飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的培養(yǎng)基上生長[16],也間接證明Ecmcat基因?qū)τ贓.coli生存的必要性[16]。這些證據(jù)充分顯示了MCAT在Ⅱ型脂肪酸合成途徑中的重要性,可以作為藥物開發(fā)的分子靶標。

為此,MCAT激發(fā)了人們極大的研究興趣,對多種生物MCAT的研究已經(jīng)取得了很大的進展。

1 Ⅱ型mcat基因分析

自1992年Verwoert等克隆了E.coli的mcat基因以來[17],已經(jīng)在多種細菌如結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、 天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginaosa)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[15,18-23],植物如玉米(Zea mays L)、歐洲油菜(Brassica napus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、 花 生 (Arachis hypogaea)[24-27]和頂復門原蟲(惡性瘧原蟲,Plasmodiumfalciparum;柔嫩艾美耳球蟲,Eimeria tenella)[12,28]等多種生物中發(fā)現(xiàn)了mcat基因的存在。通過多重序列比對分析發(fā)現(xiàn),這些基因所編碼的氨基酸序列具有較高的相似性,各物種之間的同源性在20%～33%之間;所編碼的氨基酸都存在“GXSXG”和“GQGXQ”兩個高度保守的moti f;并且通過結(jié)構(gòu)信息分析也證實這兩個moti f與MCAT的功能密切相關(guān)[18,12,15,17]。

雖然不同物種的MCAT具有許多相同特征,但是部分MCAT也存在序列特異性。P.falciparum作為頂復門原蟲中到目前為止唯一發(fā)現(xiàn)mcat基因的生物,在其長度為1 224 bp cDNA序列5＇端的一段序列與細菌對應(yīng)的基因明顯不具有同源性;利用生物信息學分析結(jié)果顯示1～309 bp編碼了一個103個氨基酸的引導肽;其中利用SignalP軟件預測顯示1～31個疏水性的殘基具有明顯的信號肽特征,其后是一段酸堿性交替出現(xiàn)的殘基(F32-N53,pI=6.2;K54-K73,pI=10.7;G74-Y103,pI=5.7),具有PfMCAT轉(zhuǎn)導肽序列特征。目前認為PfMCAT的引導肽(包括信號肽和轉(zhuǎn)導肽)功能僅僅是引導由核基因編碼的PfMCAT向效應(yīng)靶亞細胞器頂質(zhì)體(apicoplast)的轉(zhuǎn)運,與成熟 PfMCAT的功能無關(guān)[12];2003年P(guān)rigge等人體外重組表達了去除1～103個引導肽序列的成熟 PfMCAT蛋白,生化試驗證實這一無轉(zhuǎn)導肽的重組蛋白仍然具有MCAT的完整功能[12]。此外,在剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站已經(jīng)注釋了一個編號為42.m03469編碼TgMCAT的基因序列,分析結(jié)果顯示這個基因也同樣具有引導肽序列(包括信號肽和轉(zhuǎn)導肽),預測其在T.gondii的頂質(zhì)體內(nèi)發(fā)揮作用(http://www.ToxoDB.org)。

與PFMCAT基因相似的還有一些植物的MCAT基因(如 B.napus;A.thaliana等),這些植物的Ⅱ型脂肪酸合成場所也是一個與頂復門原蟲相似的亞細胞器質(zhì)體(plastid),這一類植物的MCAT基因同樣有部分序列編碼了plastid靶向的引導肽(信號肽和轉(zhuǎn)導肽[2,12,26,28]。

此外,2006年Huang等報道M.tuberculosis和M.avium不僅存在類似于大多數(shù)細菌的Ⅱ型mcat基因,同時還存在另外一個僅僅編碼224各氨基酸的mcat2基因。結(jié)核分支桿菌的mcat2基因與mcat基因所編碼的氨基酸序列僅僅有28%的同源性,并且不具有其他Ⅱ型 MCAT都高度保守的“GXSXG”motif;但是利用重組MtMCAT2進行生化分析顯示,MtMCAT2同樣可以利用E.coliholo-ACP和丙二酰單酰輔酶A作為底物,具有與Mt-MCAT相同的催化活性,推測MtMCAT2可能利用其他氨基酸殘基代替了MtMCAT絲氨酸活性位點的作用[29]。

2 Ⅱ型MCAT的結(jié)構(gòu)與作用機制

自1995年Serre等報道了E.coliMCAT的結(jié)構(gòu)以來[30],目前已經(jīng)有多種生物MCAT的結(jié)構(gòu)信息被解析(S.aureus[15],S.coelicilor[31],M.tuberculosis[32],H.pylori[33])。不同物種 MCAT的結(jié)構(gòu)在整體上都是極其相似的,每一個MCAT單體都是有2個亞結(jié)構(gòu)域組成。在N端由多個b折疊和a螺旋組成的大亞基結(jié)構(gòu)域,其核心結(jié)構(gòu)與a/b水解酶極其相似;在C端有一個類似于鐵氧還原蛋白折疊的小亞結(jié)構(gòu)域。這些酶都具有兩個與其生物學功能密切相關(guān)的保守motif,一個是在兩個亞結(jié)構(gòu)域中間形成的“深溝”(deep gorge)內(nèi)(malonyl-CoA結(jié)合位點),另外一個位于MCAT表面的ACP結(jié)合位點[30-33]。

在E.coliMCAT上,3～123和206～307位2個不連續(xù)的殘基段組成了一個較大的亞結(jié)構(gòu)域,124～205位的一段氨基酸殘基組成了較小的亞結(jié)構(gòu)域。其活性中心位于兩個亞結(jié)構(gòu)域中間形成的“深溝”(deep gorge)內(nèi),對于EcMCAT功能至關(guān)重要的親核基團Ser92位于大亞結(jié)構(gòu)域上的一個a螺旋--b折疊的轉(zhuǎn)角處,通過氫鍵與His201上的Ne2結(jié)合形成His-Ser二聯(lián)體,對EcMCAT上Ser92的突變分析顯示,Ser92突變的EcMCAT完全不具有活性;雖然E.coliMCAT大亞結(jié)構(gòu)域的核心結(jié)構(gòu)與a/b水解酶極其相似,但二者的作用機制卻明顯不同,MCAT的?；?-酶中間態(tài)是穩(wěn)定的,而當水分子親核基團通道進入水解酶中間態(tài)的活性位點時,其中間態(tài)快速解離并釋放出第一個產(chǎn)物[30,34]。

其他物種MCAT總體上都與E.coliMCAT相似,但在某些細節(jié)方面仍存在一些差異。2003年Keatinge-Clay等對S.coelicolorMCAT的晶體結(jié)構(gòu)進行了分析,結(jié)果顯示,兩者最大的不同就是在其大亞結(jié)構(gòu)域上第7個a螺旋由于增加1個轉(zhuǎn)角而延伸,第9個a螺旋變的更短,靠近C末端的第14個a螺旋增加了2個轉(zhuǎn)角進一步增長[26]。雖然Ser97-His201(以S.coelicilor的序列)形成二聯(lián)體,但是這兩個殘基突變之后的重組蛋白僅僅是降低了ScMCAT的活性而不是完全失活,與EcMCAT具有明顯差異。這也暗示在S.coelicilor中 Ser97和His201并不是其功能所必需的氨基酸殘基,有其他的殘基起到與EcMCAT上Ser92相同的功能[34]。

在2007年Zhang和 Li等人分別對H.pylori和M.tuberculosis的晶體結(jié)構(gòu)進行了解析。H.pyloriMCAT結(jié)構(gòu)與E.coli和S.coelicilor差別不大,只是在某些方面有些不同[32,33]。(1)在 E.coli(Pro52-Glu55)和S.coelicilor(Asp49-Glu52)都形成1個a螺旋的位置,在HpMCAT對應(yīng)的地方卻是一個loop。(2)在H.pyloriMCAT中的第8和第9兩個a螺旋在EcMCAT和ScMCAT對應(yīng)的是個長的a螺旋。(3)HpMCAT中的第7個b折疊在EcMCAT對應(yīng)的卻是一個loop。(4)HpMCAT中的第7個b折疊(Ala233)在EcMCAT和ScMCAT找不到對應(yīng)的結(jié)構(gòu)[33]。而MtMCAT的晶體結(jié)構(gòu)與以上這些物種的MCAT結(jié)構(gòu)相比在某些亞結(jié)構(gòu)上卻有很大的差異,MtMCAT Ser91(以M.tuberculosis的序列)的Cβ-Oγ鍵與其他MCAT結(jié)構(gòu)相比向上翻轉(zhuǎn)引起不同的導向,從而引起“活性口袋”結(jié)構(gòu)的改變。另外,His194(以M.tuberculosis的序列)并不參與形成Ser-His二聯(lián)體,而僅僅起到穩(wěn)定底物的作用[32]。

目前認為MCAT通過ping-pong bibi機制把丙二?；鶊F從丙二酰單酰CoA上的硫酯連接部位轉(zhuǎn)移到ACP的磷酸泛酰巰基乙胺臂上而形成丙二酰單酰ACP,這個反應(yīng)分為兩步來進行[30-34]。以E.coli為例,第一步是把丙二酰單酰CoA上的丙二?；鶊F轉(zhuǎn)移到活性位點Ser92上,His201激活Ser92親核黏附于形成的硫酯上,第二步是His201激活ACP上的巰基親核黏附于丙二酰基團-Ser92的中間體上,此時丙二酰單酰輔酶A上的CoA基團釋放出來;在此過程中Gln11和Leu93等殘基形成了一個氧離子洞,通過穩(wěn)定這個四面體中間復合物的負電荷來促使丙二?；鶊F向ACP巰基上的轉(zhuǎn)移形成最終的產(chǎn)物丙二酰單酰ACP[30-34]。

3 Ⅱ型MCAT與抗感染藥物研發(fā)

雖然細菌和一些植物以及頂復門原蟲分屬于低等的原核生物和相對高等的真核生物,但是兩者之間的種系進化關(guān)系差別較大。由于這些物種的脂肪酸代謝同屬于 Ⅱ型脂肪酸合成代謝途徑,其代謝相關(guān)酶在結(jié)構(gòu)和功能上又都是高度相似的。目前,已有多個研究小組還利用不同物種的MCAT基因來互補E.coli的溫度敏感的MCAT突變株(E.coli fabD89)使其在39℃恢復生長。1998年Simo等人用B.napus從文庫中篩選到一個與E.colimcat基因同源的BnMCAT,并利用這個基因片段構(gòu)建表達載體,轉(zhuǎn)化到E.coli fabD89突變株,利用BnMCAT互補其ECMCAT基因缺失的功能,能夠使其在39℃恢復生長[25];1995年Verwoert利用同樣的方法驗證了一個玉米ARF蛋白家族GTP綁定蛋白可以互補E.colifabD89突變株ECMCAT基因缺失的功能[24]。1998年Zhang等,2002年Soto等利用同源重組置換的方法分別用S.typhimurium和S.meliloti的MCAT基因片段整合到E.colifabD89突變株染色體上,替換其帶有琥珀突變的Ecmcat基因,結(jié)果顯示異源等位基因替換后的E.coli突變株能夠在39℃生長[22-23]。這些結(jié)果不僅僅能夠證明不同物種之間MCAT基因功能的相似性,更顯示出MCAT對E.coli的必需性,具有作為開發(fā)新型藥物靶標的前提條件。

在這些研究成果的基礎(chǔ)上,2006年Liu等人在HpMCAT的研究中取得了讓人驚喜的突破,通過HpMCAT的抑制動力學篩選天然化合物庫已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種植物天然提取物紫堇塊莖堿(Corytuberine)能夠有效的抑制H.pylori MCAT的活性[12,23](IC50=33 ±3.29 μ mol/L);進一步的研究顯示 ,Corytuberine是通過反競爭的機制抑制HpMCAT的活性[20]。2008年Kong等人證實胡桃醌(juglone)不僅能夠抑制 H.pylori胱硫醚 γ合成酶(cystathionine-synthase)和 β酮酯酰 ACP脫水酶(βhydroxyacyl-ACP dehydratase)的酶活性,而且可以通過抑制MCAT而使 H.pylori活性喪失,具有研制成為新型抗感染藥物的前景[7]。

作者所在課題組利用當代生物信息學和比較基因組學技術(shù)注釋得到與柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)Ⅱ型脂肪酸合成代謝途徑的關(guān)鍵酶:丙二酰單酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)?；?Malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)基因序列[28]。利用整合自殺質(zhì)粒介導的同源重組方法將E.coli mcat溫度敏感突變株(E.colifabD89)的ECMCAT基因功能性置換為去除信號肽和轉(zhuǎn)導肽的ETMCAT,成功構(gòu)建了一個帶有EtMCAT的E.coli重組菌,此重組菌在E.coli f abD89的非適應(yīng)溫度下(39℃)能夠恢復生長,初步證實EtMCAT與EcMCAT具有相同的功能。利用分子生物學技術(shù)獲得了具有酶活性的重組蛋白,并對其酶動力學和抑制動力學性特征進行了詳細研究,EtMCAT對Malonyl-CoA的Km=22.8±4.04 μ mol/L,對 holo-ACP 的 Km=20.7 μ mol/L±4.62 μ mol/L,Vmax=549.76 ±6.96 nmol/min;同時也發(fā)現(xiàn),Corytuberine不僅是EtMCAT的有效抑制劑(IC50=16.47±2.38 μ mol/L),并且在細胞培養(yǎng)模型上Corytuberine也能夠有效抑制球蟲子孢子的入侵(課題組未發(fā)表資料),這些研究資料都更進一步說明MCAT可以作為開發(fā)新型抗感染性藥物的靶標,必將成為這一領(lǐng)域的研究焦點。

4 小結(jié)與展望

雖然MCAT的研究取得了諸多的進展,但是必須看到的是這些成果主要集中與少數(shù)的細菌等一些原核生物,在頂復門寄生蟲上至今為止僅僅對P.falciparum的MCAT進行了初步的研究,目前對于其他的重要頂復門原蟲如T.gondii、艾美耳球蟲(Eimeria spp.)、隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)、微孢子蟲(Microspora spp.)、環(huán)孢子蟲(Cyclosporidium spp)等MCAT的研究幾乎一片空白。

鑒于目前抗菌、抗真菌及抗寄生蟲藥物已經(jīng)呈現(xiàn)嚴重耐藥性的現(xiàn)狀,借鑒現(xiàn)有的研究成果,系統(tǒng)地研究頂復門原蟲與細菌已被證實極其重要的藥物作用靶標--Ⅱ型MCAT,必將能夠為研發(fā)新型抗菌、抗真菌及抗寄生蟲藥物提供新的思路。

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Adcance on TypeⅡMalonyl-CoA:Acyl Carrier Protein Transacylase in Apicomplexa and Bacteria

SUN Ming-fei,LIAO Shen-quan,WU Cai-yan,QI Nan-shan,LV Minna,YUAN Jian-feng,YU Jinshu,CAI Jian-ping

(Institute of Veterinary Medicine,Guangdong Academy of Agricultural Sciences;Guangdong Common Lab of Veterinary Public Health;Guangzhou,510640,China)

Apicomplexan parasites cause high impact diseases in humans and animals.Current drugs are not efficacious,cause serious side effects,and are becoming less useful because of increased resistance to them.T herefore,there is an urgent need to develop new drugs against parasites and bacterial.Like in plants,fatty acid biosynthesis in apicomplexa and bacteria is mediated by a type II system.Since animals only possess type I enzymes,the distinct type II synthetic pathway naturally become an attractive target for chemothera-peutic intervention.MCAT is essential for fatty acid synthesis,which uses a ping-pong kineticmechanism with an bound malonyl ester as the acyl enzyme intermediate attached to a serine residue residing,would be an excellent target for antibacterial,antifungil and anticoccidial drugs discovery.

apicomplexa;bacteria;malonyl-CoA:acyl carrier protein transacylase

Q55

A

1007-5038(2011)08-0080-05

2011-01-17

國家自然科學基金項目(30471300);廣東省國際科技合作專項(2008A050200015);廣東省自然科學基金項目(1045106001006126);廣東省農(nóng)業(yè)科學院院長基金項目(201014)

孫銘飛(1978-),男,河南沈丘人,博士,助理研究員,主要從事球蟲生化代謝與入侵機制研究。