李好山綜述,熊正愛△,姚陳果審校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010;2.重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400030)

脈沖電場(chǎng)以其獨(dú)特的生物電效應(yīng)在腫瘤治療等領(lǐng)域展示出良好的發(fā)展前景,并在國(guó)際上掀起了一股研究熱潮。Weaver等[1-2]發(fā)現(xiàn)在場(chǎng)強(qiáng)為1 kV/cm級(jí)、脈寬為100 μ s級(jí)的陡脈沖作用下,細(xì)胞膜出現(xiàn)微孔的同時(shí)電導(dǎo)率發(fā)生改變,當(dāng)施加在細(xì)胞膜上的跨膜電位超過膜的絕緣強(qiáng)度時(shí),電導(dǎo)率將激增,導(dǎo)致細(xì)胞膜阻礙微粒滲透能力降低,膜上出現(xiàn)親水性孔道;當(dāng)脈沖取消后,大多數(shù)情況下微孔會(huì)關(guān)閉而不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成任何影響,這種細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時(shí)微孔的物理過程稱為電穿孔效應(yīng)。Okino等[3]首次將其與化療藥物相結(jié)合治療腫瘤,創(chuàng)立了電化學(xué)療法。進(jìn)一步研究[4-5]發(fā)現(xiàn),當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)升高到100 kV/cm級(jí)同時(shí)脈寬降低至10 ns級(jí),細(xì)胞出現(xiàn)核膜可逆性穿孔,微核產(chǎn)生,基因表達(dá)增強(qiáng);線粒體膜可逆性穿孔并導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子釋放;抑制荷瘤動(dòng)物腫瘤組織的生長(zhǎng);誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生改變等。相對(duì)于細(xì)胞電穿孔效應(yīng),這種現(xiàn)象稱為胞內(nèi)電處理效應(yīng)。盡管上述生物電效應(yīng)的機(jī)制尚不十分清楚,但陡脈沖以其獨(dú)特的電穿孔效應(yīng)和胞內(nèi)電處理效應(yīng)等重要特征已在國(guó)內(nèi)外掀起研究熱潮。Schoenbach于2004年在《Nature》預(yù)言陡脈沖將在近幾年內(nèi)可望實(shí)現(xiàn)臨床試驗(yàn)并逐步得到應(yīng)用,這種方法不需要毒性藥物的輔助作用就能達(dá)到良好的殺滅腫瘤細(xì)胞的效果,可以避免炎癥、潰瘍和化學(xué)藥物等導(dǎo)致的不良反應(yīng)。研究者們對(duì)電穿孔效應(yīng)和胞內(nèi)電處理效應(yīng)研究的實(shí)質(zhì)是陡脈沖的可逆性電擊穿效應(yīng)在腫瘤治療中的應(yīng)用。另有研究成果[6-7]表明陡脈沖不但能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生可逆性電擊穿,即電穿孔和胞內(nèi)電處理效應(yīng),而且在保證患者安全的前提下,將恰當(dāng)參數(shù)組合的陡脈沖引入到腫瘤組織中,使細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿效應(yīng),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng),可以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的,同時(shí)還可誘發(fā)機(jī)體抗血管和淋巴轉(zhuǎn)移效應(yīng)、免疫效應(yīng)等,破壞腫瘤的生存條件,有效地減少了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他部位的可能性并改善患者的生存質(zhì)量,從而提高了治療的有效性和安全性。

1 凋亡誘導(dǎo)與腫瘤治療

細(xì)胞凋亡,又叫細(xì)胞程序性死亡,是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡有利他性,使周圍的細(xì)胞長(zhǎng)得更好,或是滿足發(fā)育過程和免疫功能的需要。通過對(duì)細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究將有助于揭示免疫效應(yīng)、細(xì)胞惡變等重大生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奧秘,從而借助細(xì)胞凋亡清除有害細(xì)胞,如惡性轉(zhuǎn)化與病毒感染的細(xì)胞,成為治療腫瘤的突破口。

腫瘤的發(fā)生是因細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)而造成,失控的程度決定腫瘤是否發(fā)生,也決定著腫瘤的生長(zhǎng)速度。正常的機(jī)體可通過凋亡機(jī)制清除體內(nèi)受損而不予修復(fù)的細(xì)胞,也可清除那些癌前病變、基因改變的細(xì)胞。當(dāng)上述細(xì)胞不能通過凋亡機(jī)制予以清除時(shí),將促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生。普遍認(rèn)為,腫瘤的生長(zhǎng)速度取決于癌細(xì)胞的增殖與死亡之比,因此,治療癌癥的機(jī)制常見于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。但研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤細(xì)胞增殖速度甚至比正常細(xì)胞慢,這些腫瘤能夠持續(xù)生長(zhǎng)是因?yàn)榘┘?xì)胞的壽命延長(zhǎng)。因此,抑制癌細(xì)胞的增殖只能延緩腫瘤的進(jìn)展而不能達(dá)到治愈的目的。誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡能使瘤組織縮小甚至消失,故研究如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)治療癌癥有極其重要的意義。以往的化療、放療都是通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的,而細(xì)胞凋亡學(xué)說的建立使誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來治療腫瘤,為腫瘤治療開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。

2 脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

脈沖電場(chǎng)因其參數(shù)不同,作用細(xì)胞后細(xì)胞出現(xiàn)的變化也不同,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被證實(shí)是脈沖電場(chǎng)的生物學(xué)效應(yīng)之一,陡脈沖誘導(dǎo)凋亡機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。熊蘭等[8]用電壓峰值150 V,頻率100 Hz,脈寬 6.6 us,脈沖陡度為 138 ns,治療時(shí)間為 30 min的電脈沖處理接種walker-256瘤細(xì)胞的wistar大鼠后觀察到典型的凋亡細(xì)胞并伴有Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值的降低。曹曉哲等[9]用參數(shù)為 6×104 V/M,脈沖上升時(shí)間為20 ns,脈寬為30 us,以2.5次/min,輻照2 min的電磁場(chǎng)作用于肺癌A549細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)凋亡率為15.07%,并且抑制凋亡蛋白Bcl-2較對(duì)照組表達(dá)下降,p53蛋白則較對(duì)照組上升。趙梅蘭等[10]用脈沖電場(chǎng)作用于小鼠成纖維細(xì)胞后同樣發(fā)現(xiàn)Bc1-2蛋白表達(dá)的下調(diào),并檢測(cè)到p53蛋白表達(dá)上調(diào)。張文霞等[11]用陡脈沖作用于B細(xì)胞淋巴瘤組織,采用原位末端標(biāo)記法和免疫組化S-P法檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組,p53、Bcl-2在處理組表達(dá)分別為 80%、25%,對(duì)照組表達(dá)分別為15%、90%,推測(cè)脈沖電場(chǎng)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。楊孝軍等[12]用低能陡脈沖(電壓100 V、頻率75 Hz、脈寬 25 us)作用SKOV3卵巢癌細(xì)胞后,DNA片段化分析表明電擊后胞核DNA斷裂、出現(xiàn)梯狀條帶。Mi等[13]發(fā)現(xiàn)陡脈沖電場(chǎng)作用于人肝癌細(xì)胞SM MC-7721使線粒體電位出現(xiàn)下降,電壓為600 V,脈寬為100 us時(shí)下降更明顯,而且陡脈沖停止作用后還會(huì)繼續(xù)下降。謝肇等[14]將脈沖電場(chǎng)作用于骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞出現(xiàn)Bax/Bcl-2顯著增高,同時(shí)FasL陽(yáng)性增高。姚陳果等[15]采用場(chǎng)強(qiáng)為 10 kV/cm、脈寬為l00 ns、重復(fù)頻率為l Hz的納秒級(jí)陡脈沖電場(chǎng)作用于SKOV3癌細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到癌細(xì)胞的早期凋亡率為(22.21±2.71)%,明顯高于對(duì)照組的(3.04±0.44)%(P＜0.05),掃描和透射電子顯微鏡均觀察到典型的凋亡細(xì)胞形態(tài),證實(shí)納秒級(jí)陡脈沖電場(chǎng)能夠有效誘導(dǎo)SKOV3癌細(xì)胞發(fā)生凋亡;同時(shí)納秒級(jí)陡脈沖電場(chǎng)可明顯升高細(xì)胞鈣離子濃度,而與細(xì)胞外鈣離子濃度無關(guān)。由于納秒級(jí)陡脈沖電場(chǎng)的等值頻率很高,容易穿透細(xì)胞膜,推測(cè)其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一可能是通過激活細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體),引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,從而介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路。劉歡等[16]用脈沖作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721和正常肝細(xì)胞HL-7702發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞外無鈣離子的情況下電壓為200 V時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度出現(xiàn)下降,250 V時(shí)下降更明顯,而在胞外有鈣離子情況下電壓為150～250 V時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度變化不大,推測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度變化是陡脈沖誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。李聰?shù)萚17]用高強(qiáng)度電脈沖(參數(shù)為1 kV、1 KHz、250 ns、1 min)作用人卵巢癌細(xì)胞SKOV3后,鈣離子向線粒體流動(dòng),其含量比對(duì)照組明顯增加;Bcl-2在高強(qiáng)度電脈沖作用后mRNA顯著低于對(duì)照組,提示高強(qiáng)度電脈沖作為一種強(qiáng)的外界刺激信號(hào),作用于線粒體外膜,使凋亡信號(hào)的細(xì)胞傳導(dǎo)和發(fā)生效應(yīng)增強(qiáng),從而導(dǎo)致卵巢癌組織凋亡。楊方黎等[18]采用納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)以參數(shù)為300 ns,20 kV/cm,f=1 Hz處理人黑色素瘤細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤,也得出了脈沖電場(chǎng)能誘導(dǎo)凋亡的結(jié)論。Hofmann等發(fā)現(xiàn)場(chǎng)強(qiáng)為 4.5～8.1 kV/cm,間期為40 us的脈沖電場(chǎng)使Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài),HL-60細(xì)胞出現(xiàn)DNA片段化和核酸聚合酶的破壞,雖然凋亡與細(xì)胞內(nèi)離子關(guān)聯(lián)不明顯,但是細(xì)胞懸液中含有一定濃度的離子是必需的。Beebe等[19]研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度電場(chǎng)(場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到 300 kV/cm)作用于人Jurkat和HL-60細(xì)胞脈沖到納秒級(jí)(10～300 ns)觀察到細(xì)胞內(nèi)Caspase激活、細(xì)胞色素C釋放,細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,由于ns級(jí)脈沖主要作用于胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)而非細(xì)胞膜,所以,凋亡的誘導(dǎo)與胞膜穿孔關(guān)系不明顯。Hall等[20]在研究p53基因在納秒脈沖誘導(dǎo)凋亡作用時(shí)發(fā)現(xiàn),納秒脈沖在作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116后只有Bax和cytochrome C水平升高的細(xì)胞出現(xiàn)胞膜皺縮,p53+/+和p53-/-的細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡的機(jī)會(huì)是均等的,提示納秒脈沖誘導(dǎo)凋亡是非特異性的,其途徑或許是獨(dú)立于線粒體途徑的。Richard等[21]用場(chǎng)強(qiáng)為40 kV/cm,脈寬為300 ns的脈沖電場(chǎng)作用于鼠黑色素瘤,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞出現(xiàn)壞死的同時(shí)觀察到細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,DNA片段化,腫瘤血供減少而誘發(fā)的凋亡。Kim等[22]報(bào)道用參數(shù)為60 Hz,14 us的電磁場(chǎng)作用于BALB/c小鼠,原位末端標(biāo)記法檢測(cè)到睪丸生殖細(xì)胞出現(xiàn)較高的凋亡率,電鏡下發(fā)現(xiàn)退化的睪丸生殖細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮。Noriaki等[23]用低電壓脈沖作用于鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,當(dāng)參數(shù)設(shè)置為電壓場(chǎng)強(qiáng)為7.5 V/mm,脈寬為1 000 ms時(shí)凋亡達(dá)到了(10.5±1.6)%,對(duì)照組僅為(2.8±0.3)%。

3 陡脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制及應(yīng)用前景

從國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來看,盡管以可逆性電擊穿(電穿孔、內(nèi)處理)和不可逆性電擊穿的方法做了大量的實(shí)驗(yàn)和理論研究工作,脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制推測(cè)有以下原因:(1)通電后,由于細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變,質(zhì)子和其他離子在電場(chǎng)內(nèi)移動(dòng)擴(kuò)散,陰離子移向正極,陽(yáng)離子移向負(fù)極,使陽(yáng)極呈強(qiáng)酸性,陰極呈強(qiáng)堿性,局部強(qiáng)酸、強(qiáng)堿可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。(2)陡脈沖作用過程中,不斷有少量氣泡自電極插入處冒出,推測(cè)陽(yáng)極產(chǎn)生氧氣、氯氣,陰極產(chǎn)生氫氣等氣體。這些氣體是強(qiáng)氧化劑或還原劑,具有殺傷腫瘤細(xì)胞,誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用。(3)陡脈沖劑量較小時(shí),電激液幾乎無升溫,但當(dāng)陡脈沖劑量較大時(shí),處理組溫度較對(duì)照組有明顯升高。治療過程中的局部高溫除導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死亦有誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用。(4)在電滲透作用下,水從陽(yáng)極移向陰極,造成陽(yáng)極凝固性壞死,陰極液化性壞死,并導(dǎo)致血管收縮、微血栓形成,腫瘤組織缺血缺氧也可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。(5)變化的脈沖電場(chǎng)能引起細(xì)胞跨膜電位的變化,導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高,激活DNA內(nèi)切酶,使逃離細(xì)胞凋亡程序的癌細(xì)胞凋亡。但是由于生物體本身的介電特性、阻抗特性和生物電效應(yīng)的復(fù)雜性以及使用的研究方法和手段的局限性,有關(guān)陡脈沖應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究很多,但對(duì)于陡脈沖電穿孔、內(nèi)處理特別是不可逆性電擊穿三者的窗口效應(yīng)及規(guī)律,至今尚無統(tǒng)一理論能夠正確地解釋各自的作用機(jī)制,也就是說,陡脈沖在腫瘤治療中的生物電效應(yīng)作用機(jī)制等共性基礎(chǔ)問題的研究則顯得較為膚淺,上述陡脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制也不是都確切明了。然而眾多實(shí)驗(yàn)研究確切地證實(shí)了陡脈沖作用后細(xì)胞發(fā)生凋亡的存在,而且鑒于細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中的巨大潛力,這些事實(shí)激發(fā)了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其確切機(jī)制的研究興趣,盡管陡脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究過程中還有很長(zhǎng)的路要走,相信不遠(yuǎn)的將來陡脈沖會(huì)給患者帶來福音。

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