歐陽達(dá),張淑貞,付騰騰,戴思維 (長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北荊州434025)

魔芋 (Amorphophalms konjac)為天南星科魔芋屬多年生草本植物,中國為其主產(chǎn)國之一,其主要成分為葡甘露聚糖,是一種重要的保健食品,同時是一種新材料和新資源,因而廣泛用于醫(yī)藥和工業(yè)。近年來深加工產(chǎn)品出口量加大,市場需求量大,供不應(yīng)求,導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整,使魔芋成為山地主要的經(jīng)濟作物之一。而傳統(tǒng)的繁殖方法效率低下,使魔芋的品質(zhì)下降,阻礙了魔芋的大面積生產(chǎn),制約著魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近些年,很多研究者將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于魔芋的種球繁殖上,試圖解決魔芋的種苗短缺和品質(zhì)下降等問題,取得了一定效果[1～6]。本研究通過對魔芋的愈傷誘導(dǎo)、分化和生根誘導(dǎo)等進(jìn)行試驗,試圖為魔芋良種繁育和產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為魔芋塊莖,采用野生的魔芋塊莖為外植體,經(jīng)過嚴(yán)格的消毒處理后用于實驗。以MS(蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、pH5.8)為基本培養(yǎng)基,通過與植物生長調(diào)節(jié)劑結(jié)合形成不同的組合培養(yǎng)基。選用的植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA和6-BA。

1.2 材料處理及外植體滅菌

將采集的材料洗凈,置于無菌操作臺上,然后切成2cm×2cm×2cm小方塊,放入70%的酒精浸泡約1min,然后用0.1%HgCl溶液中滅菌10min,然后用無菌水沖洗5次,切割成5mm×5mm×5mm小方塊,接種于培養(yǎng)基上。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基,附加6-BA和NAA不同水平形成不同的組合培養(yǎng)基:組合培養(yǎng)基CM1組成為MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM2為MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM3為MS+1.50mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM4為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,CM5為MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA。在避光、(26±2)℃條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.4 愈傷組織繼代及分化

繼代培養(yǎng)基:CM2和CM4、CM2+檸檬酸和CM4+檸檬酸、CM2+維生素C和CM4+維生素C。組織培養(yǎng)在避光、(26±2)℃條件下進(jìn)行。分化培養(yǎng)基:CM3、CM6(MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)、CM7(MS+2.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)、CM8(MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)。在光照14h/d、(26±2)℃條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.5 愈傷組織生根培養(yǎng)

培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。在光照14h/d、(26±2)℃條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

塊莖切塊接種于不同的培養(yǎng)基上,經(jīng)過10d左右的暗培養(yǎng),表面逐漸變成褐色,隨后出現(xiàn)膨大,質(zhì)地疏松,顏色為粉紅色。20d后出現(xiàn)致密的芽點,愈傷組織明顯膨大,質(zhì)地變得相對緊密。試驗結(jié)果顯示,在CM2和CM4 2個組合培養(yǎng)基上,愈傷組織的生長速度和誘導(dǎo)效果最好。誘導(dǎo)率分別為71.7%和56.4%。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合為CM2,即MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。

2.2 愈傷組織的繼代及分化

在試驗條件下,CM4內(nèi)的愈傷組織增長速度和愈傷組織的質(zhì)量最好,在此條件下的愈傷組織能夠很好的增殖,褐化的程度最輕,愈傷組織的顏色呈現(xiàn)粉紅色。其他培養(yǎng)基內(nèi)的愈傷組織大多呈現(xiàn)白色、淡綠色質(zhì)地較粉紅色愈傷緊密,生長速度較緩慢,隨時間的推移逐漸變?yōu)榈稚挠鷤M織。愈傷組織增殖最佳組合為CM4,即MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。

形成的愈傷組織的繼代時期為第21d,此時轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基最佳,過早過晚都不利于其繁殖。將愈傷組織切成5mm×5mm×5mm小方塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上,進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)。10d后在部分愈傷組織上分化出芽點,經(jīng)過20d左右大多數(shù)愈傷組織的表面開始陸續(xù)出現(xiàn)凹凸不平的生芽點,其中小部分不定芽長到3cm左右,30d后不定芽分化出綠色的葉片。

雖然CM2是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基,但在增殖階段CM4中的愈傷組織生長狀況總體比CM2的好。即含植物調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)劑較少的培養(yǎng)基有利于愈傷組織的增殖。同樣在芽分化的誘導(dǎo)中,CM6的效果較好且利于接下來的根分化實驗的進(jìn)行,可能是經(jīng)歷了植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的低-高-低的變化后有效避免了褐化問題,這一點與黃遠(yuǎn)新等[1]的研究相一致。

2.3 試管苗的的誘導(dǎo)

由于魔芋的芽為葉芽,且僅一片復(fù)葉,莖的生長點在葉柄的基部內(nèi)。因此,當(dāng)分化形成的植株進(jìn)入岀葉期時,需要連同少量的愈傷組織一起切下來轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。試驗結(jié)果表明,經(jīng)過7d誘導(dǎo),即有少量的根毛狀不定根出現(xiàn),21d后在培養(yǎng)基內(nèi)部可見大量的白色根系生成,生根率高達(dá)100%。

3 結(jié)論與討論

1)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下,不同培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)愈傷組織的形成。6-BA和NAA過高過低都不利于愈傷組織的誘導(dǎo),誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,愈傷組織增殖最佳組合為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA;愈傷組織芽分化最佳的培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。

2)培養(yǎng)效果主要取決于6-BA與NAA濃度比。NAA濃度應(yīng)維持在較低水平,在此前提下,比值低則利于愈傷組織誘導(dǎo),比值高則利于不定芽分化。這與黃丹楓等[6]的研究結(jié)果是一致的。

3)采用降低無機鹽和激素濃度,并結(jié)合生長調(diào)節(jié)劑濃度低一高一低交替采用,以及控制光照等,可在愈傷組織褐化上取得良好效果。褐化是植物組織培養(yǎng)過程中影響培養(yǎng)物繼續(xù)生長、增殖和后續(xù)的誘導(dǎo)分化,還是寄栽成活率高低的主要因子。導(dǎo)致離體培養(yǎng)組織褐化的因素很多,木本植物克服褐化的辦法常采用改變培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)過程中控制光照強度等。在魔芋組織培養(yǎng)中,這方面研究很少。本研究所進(jìn)行的相關(guān)試驗僅僅是初步探索,為科學(xué)指導(dǎo)生產(chǎn)尚需進(jìn)一步開展比較系統(tǒng)地試驗研究,特別是大田實證試驗研究。

致謝:本研究得到長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院周燚副教授大力幫助,在論文寫作和修改中得到長江大學(xué)國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目指導(dǎo)老師朱建強教授的悉心指導(dǎo),在此謹(jǐn)致謝忱!

[1]黃遠(yuǎn)新,何鳳發(fā),張盛林.魔芋組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,25(4):309-312.

[2]馬崇堅,彭誠聰.魔芋塊莖組織培養(yǎng)及植株再生[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,(3):103-105.

[3]呂世安,沈艷芬,黃元勛,等.魔芋組織培養(yǎng)及試管苗快繁原原種芋技術(shù)研究 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,(6):68-70.

[4]謝玲玲,趙青華,降巧龍.魔芋莖尖脫毒試管苗培養(yǎng)基的篩選 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(34):14891.

[5]謝玲玲,趙青華,降巧龍.魔芋莖尖試管苗培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(30):14627-14628.

[6]黃丹楓,陸文初.細(xì)胞分裂素與魔芋組織培養(yǎng)器官發(fā)生研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1993,15(6):522-526.