熊 濤 長江大學長江中游濕地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心,湖北荊州434025 長江大學生命科學學院,湖北荊州434025

萬 燦,倪鳳娥,張 楓 (長江大學長江中游濕地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心,湖北荊州434025)

血吸蟲病是由血吸蟲寄生于人體引起的地方性寄生蟲病。寄生于人體的血吸蟲主要有3種:即流行于非洲北部的埃及血吸蟲;流行于拉丁美洲及非洲中部的曼氏血吸蟲以及流行于亞洲的日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)[1-2]。在我國因只有日本血吸蟲病流行,故通常將日本血吸蟲病簡稱為血吸蟲病。日本血吸蟲病在我國長江流域和長江以南的13個省、直轄市、自治區(qū)嚴重流行,解放初期估計有患者上千萬人,是我國危害最為嚴重的寄生蟲病[3-4]。血吸蟲也稱裂體吸蟲 (schistosoma),寄生在宿主靜脈中的扁形動物。血吸蟲寄生于多數(shù)脊椎動物,寄生人體的有 6種:曼森氏裂體吸蟲(S.mansoni,即曼氏血吸蟲)寄生在大、小腸靜脈中,主要分布于非洲和南美洲北部[5-8]。蟲卵隨糞便排出。幼蟲進入中間宿主螺體內(nèi),再通過皮膚回到終宿主人體內(nèi)。寄生于人體的血吸蟲在形態(tài)、生理和生活史等方面,有許多不同于其它人體寄生吸蟲的地方,如血吸蟲系雌雄異體;成蟲在腸系膜靜脈或膀胱靜脈叢寄生,蟲卵從糞或尿中排出,因蟲種而異;尾蚴尾部分叉,在水中經(jīng)皮膚侵入縮主;生活史中無雷蚴和囊蚴階段等[9]。

日本血吸蟲純凈蟲卵的大量制備和純化是對日本血吸蟲及血吸蟲病研究的重要一環(huán),血吸蟲蟲卵抗原的制備及研究、血吸蟲蟲卵RNA和DNA的提取、血吸蟲蟲卵體外培養(yǎng)及血吸蟲蟲卵的發(fā)育過程或其影響因素的研究、建立動物的肺或肝臟組織血吸蟲蟲卵肉芽腫模型以及血吸蟲病發(fā)病機制的研究等都涉及血吸蟲蟲卵的分離和純化[10-11]。制備的純凈蟲卵可為血吸蟲病診斷、疫苗研制和新藥研究等提供大量的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

受試動物:采用4只健康普通雜種家兔,雌、雄隨機,體重2.1～2.3kg,7～9月齡,購自寵物市場。

主要試劑有:0.25%胰蛋白酶溶液(中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司)、自制 PBS(pH7.2,1000ml溶液中含8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)pH,高壓滅菌)、自制1%NaCl溶液。

主要儀器:低速大容量離心機DL-5-C(上海安亭科學儀器廠)、高速組織搗碎機DS-1(上海標本模型廠)、標準分樣篩 (上虞市五四建材儀器廠)、顯微鏡 (Leica Microsystens lnc.)、超凈工作臺 (上海蘇達實驗儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、調(diào)速離心機TGL-16G(上海安亭科學儀器廠)、冰箱 (新飛BCD-173K)、電子天平 (Made by Sartorius)、高壓滅菌鍋 (上海三申醫(yī)療器械有限公司)、50ml和1.5ml離心管。標準分樣篩及所用容器,包括高速組織搗碎機的盛器在使用前均需121℃滅菌20min。

1.2 方法

(1)動物感染 將4只普通家兔 (雌、雄隨機)每兔感染4500～5000條尾蚴,于感染后30d耳后靜脈注射空氣處死,于超凈工作臺中解剖,摘取其肝臟。

(2)勻漿前準備 從人工感染4500～5000條尾蚴30d后的兔中取出肝臟于消毒器皿中,除去膽管、血管及結(jié)締組織,用消毒的4℃預冷的1%NaCl溶液洗凈血污,將肝臟剪成小碎塊。

(3)勻漿 在肝臟碎塊中加入600ml 4℃預冷的1%NaCl溶液,一并倒入高速組織搗碎機中,以10000～12000r/min分3次勻漿,每次3min,間隔5min。搗碎完后,用4℃預冷的1%NaCl溶液稀釋。

(4)分級分離 稀釋后的勻漿先后用80、100、120、200目分樣篩過濾,收集濾液于無菌容器中,濾渣重復用4℃預冷的1%NaCl溶液沖洗,直至濾渣經(jīng)鏡檢觀察,幾乎沒有血吸蟲蟲卵方可棄去濾渣,最后每只兔可收集濾液1500ml左右。將濾液立即倒入50ml離心管內(nèi),以3500r/min離心1min,棄去上液,下層沉淀反復用4℃預冷的1%NaCl溶液洗滌—中速低溫離心—去上液,反復3次后,上液基本澄清,收集沉淀于50ml離心管中。

(5)消化 向收集好的沉淀中加入40ml 4℃預冷的0.25%胰蛋白酶溶液,于37℃生化培養(yǎng)箱中消化,在顯微鏡下觀察,根據(jù)肝組織碎片的多少可適當改變消化時間。消化4h后,鏡檢可看到肝組織殘片被消化為單個細胞。

(6)純化 用PBS(pH7.2)稀釋消化后的蟲卵,經(jīng)360目分樣篩過濾,肝組織碎片及少數(shù)小的蟲卵隨液體流出,留在篩子上的蟲卵用PBS(pH7.2)沖洗下來,并用260目分樣篩過濾,進一步除去未消化完全的肝組織殘片及實驗過程中引入的漂浮雜質(zhì)。將濾液轉(zhuǎn)入50ml離心管中,4000r/min離心5min,去上清,用移液槍取少量管底蟲卵于顯微鏡下觀察,可見所獲得的蟲卵非常純凈。將其分裝于1.5ml離心管中,12000r/min,離心30s,進一步去除蟲卵中的水分,4只兔共獲得純凈蟲卵2.63ml,將其存入-20℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與分析

感染4500～5000條尾蚴的兔,每只可收集0.66ml左右的純凈蟲卵,在顯微鏡下 (10×40)可見背景干凈,蟲卵內(nèi)部結(jié)構(gòu)及整個外部輪廓清晰、完整,并可見獲得毛蚴從卵殼中涌出 (圖1),整個分離過程耗時較短,因此,對蟲卵的活力影響較小,毛蚴孵化率可達80%以上 (8h,27℃)。

3 討論

現(xiàn)有獲得血吸蟲蟲卵及其純化的數(shù)種方法均有一定缺陷,如Coker等[12]將感染動物處死后置于冰箱中冷藏1～2d再處理肝臟,這樣能有效減少后續(xù)分離過程中的肝組織碎片,有利于提高蟲卵純度,但延長了蟲卵分離的時間,難以保持蟲卵內(nèi)物質(zhì)活性。徐克繼等[13]提純蟲卵的方法,耗時長,且純化后蟲卵仍含有不少肝組織碎片。劉蘭英等的提純法獲得的蟲卵相對純凈,但純化過程較繁瑣,且純度較差,每個高倍視野下仍可見肝細胞。周松華等[14]提純法雖然蟲卵分離得較好,但破殼卵多,損失大,對蟲卵抗原的活性有影響。目前獲取無菌日本血吸蟲蟲卵的方法主要是在體外無菌條件下培養(yǎng)成蟲而獲得。Rodrigues等[15]所述的用低速及超聲波處理的蟲卵,雖然蟲卵純化效果較好,但損失較多,且活力幾乎喪失。楊靜等[16]發(fā)現(xiàn)841和891 2種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的血吸蟲,隨著培養(yǎng)時間的增加,成蟲產(chǎn)卵畸卵率明顯升高。在體外培養(yǎng)到第11～14天,841和 891畸卵率分別為 (80.3±12.7)%及 (58.9±9.2)%。培養(yǎng)第15天,841和891培養(yǎng)基的成熟期蟲卵分別為 (28.4±8.3)%及 (30.1±7.8)%;死卵分別為 (55.5±7.8)%及 (51.9±8.3)%。所以現(xiàn)行各種血吸蟲蟲卵收集方法或難以達到較高純度,或獲得的蟲卵活力低,致畸率及致死率較高。本研究通過肝臟勻漿反復過篩以除去肝組織碎片,可節(jié)省時間,提高工作效率。作者認為蟲卵純化的關(guān)鍵在于先將大于蟲卵體積的肝臟碎塊進行消化,然后加預冷的PBS(pH7.2)稀釋,經(jīng)360目/in分樣篩過濾,可除去肝細胞碎片,殘留物經(jīng)260目/in分樣篩過濾,又可除去大的碎片,最后可獲得純凈的蟲卵。此外,過篩時纖維殘渣不要輕易丟棄,可采用反復洗滌、過濾、離心的方法,進一步將其中的蟲卵分離出來,以提高蟲卵的收獲率。本方法具有操作簡便、分離速度快、獲蟲卵數(shù)量多、純度高、費用低等優(yōu)點,由于整個分離純化過程在數(shù)小時內(nèi)完成,故對蟲卵活性影響較小。本法制備的純凈蟲卵可為血吸蟲病診斷、疫苗研制和新藥研究等提供大量的實驗材料。

圖1 血吸蟲未成熟蟲卵顯微鏡觀察圖

[1]毛守白.血吸蟲生物學與血吸蟲病的防治 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1990:8.

[2]Cheever A W.T he intensity of experimental schistosome infections modulates hepaticpathology[J].Am J T rop Med Hyg,1998,35:123-124.

[3]吳玲娟,徐潘生,宣堯仙,等.口服青蒿琥酯早期治療預防日本血吸蟲病的實驗研究 [J].中國血吸蟲病防治雜志,1995,7(3):127-129.

[4]王大坤,段 凱,鄭 宏,等.吡喹酮治療前后感染日本血吸蟲兔循環(huán)29/43KD分子的水平和意義[J].中國人獸共患病雜志,1994,10(5):23-25.

[5]Capron M,Capron A.Rats,mice and men-models for immune effector mechanisms against schistosom iasis parasitol[J].T oday,1986,2:65-69.

[6]Satoh M,Nara T,Janecharut T,et al.Squirrel monkeys as a useful vaccine model for Schistosoma japonicum infection[J].Parasitol Int,1997,46:28-31.

[7]Capron A,Dessaint J P,Capron M,et al.Immunity to schistosomes progress toward vaccine[J].Science,1987,238:1055-1065.

[8]Grzy ch J M,Capron M,Dissous C,et al.Blocking activity of rat monoclonal antibodies in experimental schisto somiasis[J].Immu-nol,1984,133:985-998.

[9]Liu S X,He Y K,Song G C,et al.Anti-fecundity immunity to Schistosoma japonicum induced in Chinese water buffaloes(Bos buffelus)after vaccination with recombinant 26kDa glutathione-S-transferase(reSjc26GST)[J].Vet Parasitol,1997,69:36-39.

[10]帥連云,曹建平,仇錦波.日本血吸蟲純凈活蟲卵的制備[J].鎮(zhèn)江醫(yī)學院學報,1998,8(4):574-575.

[11]王衍海,彭鴻娟,顧金保.日本血吸蟲純凈活蟲卵制備方法的改進 [J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2008,26(2):36-38.

[12]Co rker C M,Lichtenberg F.A revised method for isolation of Schistosoma mansoni eggs for biological experimentation[J].Biol M ed,1956,92:780-782.

[13]徐克繼,裴曉康,樊培方.自病兔肝臟分離血吸蟲純卵的方法[J].上海醫(yī)學院學報,1958,1(1):75-77.

[14]周松華,汪世平.簡便快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵方法的研究 [J].中國血吸蟲病防治雜志,2007,19(2):128-130.

[15] Rodrigues V,Chaudhri M,Knight M,et al.Predicted structure of major Schistosoma mansoni eggshell protein[J].Molecular and Biochemical Parasitology,1989,32:7-8.

[16]楊 靜,李 瑛,周述龍.日本血吸蟲成蟲在體外培養(yǎng)中產(chǎn)卵和蟲卵發(fā)育成熟的影響因素研究 [J].湖北醫(yī)科大學學報,1997,18(4):308-309.