趙 玲,邱 倩綜述,楊 鷹△審校

(1.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院婦產科,重慶 400037;2.河南開封市第155醫(yī)院內二科 475000)

側群細胞(side population,sP)是一類具有干細胞特性,能夠排出活性污染Hoechst33342而具有弱熒光染色特性的細胞。利用這一特性,sP細胞可以通過免疫熒光激活細胞法結合流式細胞儀被分選,目前在人、鼠多種卵巢癌細胞株及患者腹水中成功分選、鑒定、培養(yǎng),證實了sP細胞的存在,并證實其與腫瘤干細胞之間存在一致性。基于對sP細胞生物學特性的研究,進一步了解腫瘤干細胞在基因調控、信號轉導等方面的研究,并且為研究卵巢癌干細胞創(chuàng)造有價值的細胞模型。本文就sP細胞在卵巢癌干細胞中的研究進展作一綜述。

1 側群細胞的發(fā)現

1996年Goodell等[1]在研究鼠造血干細胞(hemaopoies stem cells,HSCs)的過程中,用熒光染料 Hoechst33342染色小鼠骨髓細胞后,經流式細胞儀檢測,在流式二維分析點陣圖上發(fā)現一小群具有弱熒光染色或拒染特性的細胞,呈彗星狀分布在細胞主群的一側,他們將這群細胞稱為側群細胞(side population,sP),也稱邊群細胞。這類細胞約占骨髓細胞比例0.05%,雖然含量很低,但具有很強的造血干細胞活性,重建能力是普通骨髓的1000倍。目前,sP細胞已經成為一種常用的分離造血干/祖細胞的方法。甚至有學者認為sP細胞可作為鑒定干細胞的標志之一。繼骨髓中分離出sP細胞之后,陸續(xù)在人和動物的許多正常組織中發(fā)現sP細胞的存在,如乳腺、心臟、肝臟、肺、腦組織、神經組織、小腸、氣管、皮膚表皮組織、子宮內膜、子宮平滑肌、羊膜等中,發(fā)現sP細胞具有自我更新和多項分化潛能[2-7]。

隨著人們對干細胞的深入了解及惡性腫瘤病因學的研究,發(fā)現腫瘤是一種干細胞疾病。腫瘤干細胞學說的提出[8],如何能成功分離和鑒定腫瘤干細胞就顯得尤為重要,形態(tài)學上很難區(qū)分腫瘤細胞和腫瘤干細胞,只能在功能學上來鑒定腫瘤干細胞。目前腫瘤干細胞分離方法主要有3種:利用腫瘤干細胞的表面標志、無血清培養(yǎng)懸浮生長細胞球和sP細胞分選法。在仍不能完全確定某種特性類型腫瘤干細胞表面特異性膜蛋白標記,sP細胞分選法仍不失為分選腫瘤干細胞的一種常用方法。隨著人們逐步開始研究sP細胞的生物學特性,在多種惡性腫瘤細胞株及腫瘤組織中檢測sP細胞的存在,并證實其富含腫瘤干細胞樣特性。最近的研究工作在淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、喉癌、髓母細胞瘤、子宮內膜腺癌等[9-14]細胞系中檢測出sP細胞的存在,并在人實體瘤腫瘤組織原代培養(yǎng)(如肝癌[15]、人神經母細胞瘤[16])中也檢測有 sP細胞的存在,并初步研究sP細胞含量與腫瘤惡性程度的相關性。在對卵巢癌腫瘤干細胞的研究中,Szotek等[17]于2006年從鼠卵巢癌細胞系 MOCAR-7和 4306、人卵巢癌細胞系(IGROV-1,SKOV-3,OVCAR-3)和患者腹水細胞中檢測出sP細胞,并培養(yǎng)研究其生物學特性。Hu等[18]在卵巢癌Ⅲ期患者腹水、卵巢癌細胞株(OVCAR3、A2780、A2780-CP,HEYA8、OCC1、SKOV3)異體移植免疫缺陷性小鼠培養(yǎng)后分選及鑒定出具有干細胞樣特性的sP細胞。王偉等[19]在人卵巢癌細胞系OVCAR-3中檢測sP亞群細胞具有很強的成瘤性和侵襲性,認為其具有一定的腫瘤干細胞樣特性。雖然目前尚不能證明sP細胞亞群中百分之百的細胞都具有干細胞特性,同時并非所有腫瘤干細胞都具有sP細胞的特性,但其的確富集了具有引起并維持腫瘤發(fā)生發(fā)展能力的極少數干細胞樣細胞。目前實驗報道卵巢癌腫瘤干細胞的標記的說法不一,如CD44、CD117、CD24、CD133等,尚無特異的表面標記物,sP細胞分選法作為腫瘤干細胞分離純化方法得到廣泛應用,并得到肯定。用sP細胞來分選并富集卵巢癌腫瘤干細胞是可行的。因此具有sP細胞表型的干細胞將是研究卵巢癌腫瘤干細胞生物學特性的細胞模型,可以作為研究卵巢癌干細胞的重要資源。

2 卵巢癌sP細胞生物學特性的初步鑒定

2.1 sP的細胞表型 sP細胞膜表面高表達ATP結合盒轉運子超家族,包括多藥抵抗蛋白I(Mdela/1b,mouse;MDR1,human)和乳腺癌耐藥蛋白1(breast cancer resistance protein1,Bcrp1)/ATP結合轉運子G2(ATP-blinding cassette,subfamily G,member 2,ABCG2)。ABCG2是一種P-糖蛋白,屬 ATP結合框轉運體(A TP-binding cassette transponer,ABC)家族所介導的腫瘤細胞多重耐藥分子家族中的一種,屬跨膜藥物轉運蛋白,是抗腫瘤藥物難以發(fā)揮效應的關鍵耐藥蛋白,該蛋白質由多藥抗性蛋白質1(multidrug resistance protein1,MDR1)基因和多藥抗性相關蛋白(multidrugresistance associated protein,MAP)基因編碼[20],這些轉運蛋白可以被維拉帕米抑制,在實驗研究中就發(fā)現sP細胞具有把染料Hoechst33342泵出細胞外的特性與ABCG2有關。在對卵巢癌細胞株A2780分選sP細胞實驗中已證實[21],sP細胞中ABCG2分子的表達量明顯高于Non-sP細胞,ABCG2+細胞對化療藥物的耐受能力則明顯高于ABCG2-細胞,且ABCG2+細胞加人ABCG2單克隆抗體孵育后能使ABCG2-細胞對化療藥物的耐受性明顯降低,說明ABCG2分子是參與維持卵巢癌細胞多藥耐藥性的一個主要分子標志。因此推測ABCG2分子可能是卵巢CSC表面的一個特異性分子標志,ABCG2/Bcrp1作為確定sP細胞的重要表型標記。研究者在采用sP細胞分選法來分離腫瘤干細胞時,流式細胞儀檢測到sP細胞的存在后,加入維拉帕米后sP細胞比例減少,表明ABCG轉運蛋白對維拉帕米敏感,其活性在維拉帕米存在的情況下有所減弱。并提出將熒光染料Hoechst33342外排、維拉帕米敏感、BCRP1+sP細胞有可能作為一種標記去用于檢測和分離卵巢癌干細胞的一種生物學特性。

在Szotek等[17]通過流式細胞儀對人和鼠卵巢癌細胞系檢測中發(fā)現MOVCAR-7中 sP細胞高密度表達 c-kit/CD117、CD44,但在細胞系4306和人腹水中不能表達,在MOVCAR-7和4306細胞系中 sP細胞和Non-sP細胞均不表達CD24、CD34、CD105、CD133、SCA-1。目前在卵巢癌細胞株中檢測的表面標記物與腫瘤干細胞、sP細胞之間存在一定的相關性,仍不能證明所有的sP細胞都含有表面標志物,也不能證明sP細胞表面標記物的特異性。這就需要今后大量實驗研究上有所進一步突破。

2.2 sP細胞的自我更新增值成瘤能力 sP細胞在腫瘤中的生物學特性可概括為具有自我更新、多向分化和高致瘤性,對放療、化療具抵抗性,與腫瘤干細胞生物學特性具相似之處。卵巢癌sP細胞可以通過對稱和不對稱細胞分裂的方式獲得自我更新能力,在體外長時間克隆增殖。這一生物學特性與干細胞和腫瘤干細胞有類似的特性,為sP細胞具有腫瘤干細胞樣特性提供依據。目前研究者在卵巢癌細胞株及患者腹水細胞中培養(yǎng)sP細胞,觀察其生物學特性。Szotek等[17]在鼠卵巢癌細胞系MOVCAR7和4306、王偉等[19]均在人 OVCAR3細胞系中分選sP細胞并培養(yǎng)過程中證實sP細胞可發(fā)生不對稱分裂增殖,sP細胞不僅可以產生sP細胞,還可以產生Non-sP細胞,而Non-sP細胞培養(yǎng)后不能產生sP細胞。并且在多次傳代培養(yǎng)中發(fā)現sP細胞的比例不斷升高,而Non-sP細胞體外增值受限。Patrawala等[22]在分析前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌的腫瘤細胞株中證實,盡管sP細胞含量很少(0.01%～5%),但與Non-sP細胞相比,其具有高成瘤性。張弦等[23]在人卵巢癌細胞株A2780中,分選培養(yǎng)的sP細胞的平板克隆率及軟瓊脂克隆率均明顯高于Non-sP細胞;裸鼠體內致瘤實驗中,2周內sP細胞組有2只裸鼠長出了腫瘤(2/3),Non-sP細胞組在8周后仍無腫瘤生長(0/3)。Moserle等[24]也在人卵巢癌建立的細胞株中和異體移植后證實,sP細胞有較高的分芽、增殖、細胞凋亡率減少和高成瘤性。同一細胞株來源,且用相同細胞數量、同等時間內觀察sP細胞的自我更新、克隆增殖、成瘤性等方面,sP細胞明顯優(yōu)于Non-sP細胞。這些生物學特性均為腫瘤干細胞的重要特征,因此可以證實卵巢癌sP細胞具有腫瘤干細胞最重要的特征。

3 側群細胞與腫瘤干細胞之間的關系

近年來腫瘤干細胞的研究表明,多種惡性腫瘤的細胞系和腫瘤組織中都含有富含腫瘤干細胞樣的亞群。在分離培養(yǎng)過程中,這些細胞具有自我更新、多分化潛能、高致瘤性、對放化療的抵抗性等特性,與腫瘤干細胞生物學特性具相似之處。鑒于sP細胞的高致瘤性和增生潛能,人們廣泛猜測sP細胞群體可能也包含腫瘤干細胞。分選后sP細胞群體更具克隆原性,與Non-sP細胞相比,在低細胞密度下優(yōu)先存活。而且越來越多研究發(fā)現,腫瘤組織中存在具有干細胞特征的sP細胞,并將sP分選法可作為鑒定腫瘤干細胞的新方法。

sP細胞與腫瘤干細胞之間在生物學特征上存在一致性,但隨著對sP細胞的不斷研究,發(fā)現二者之間也存在一定的差異性。在人、鼠卵巢癌細胞株和人腹水細胞中分選的sP細胞時就發(fā)現,不是所有的卵巢癌細胞株中都能分選出sP細胞。而且在不同的細胞株中sP細胞的含量亦不盡相同,如Kondo等[25]報道,人乳腺癌細胞系MCF7和人宮頸癌細胞系Hela細胞中分別含有2.0%和 1.2%的sP細胞,而Parawala等[22]在MCF7中僅檢測到約0.2%的sP細胞,在Hela細胞中未檢測到sP細胞的存在。雖不能排除實驗技術、條件、試劑等人為因素的影響,但也看到sP細胞與腫瘤干細胞之間存在差異性。隨著研究進一步的深入,有觀點提出不是所有的腫瘤干細胞都含sP細胞,sP細胞只是富集腫瘤干細胞樣特性的一個亞群,其中部分細胞并非腫瘤干細胞;而且所有腫瘤干細胞都具有sP表型。各實驗室用流式細胞儀分離獲得sP細胞的數量和特性存在一定的差異,這就仍需大量反復實驗研究,在工作中發(fā)現優(yōu)化sP細胞分選條件,盡量減少一些人為或環(huán)境因素。sP細胞是否完全具有卵巢癌干細胞的功能特性有待今后的實驗考證。

4 側群細胞研究中存在的問題

鑒于sP細胞的分選主要是依靠外排熒光染料 Hoechst33342的特性。關于Hoechst33342染料是否具有細胞毒性說法不一。早在1982年Fried等[26]年就提出其是一種細胞DNA合成的抑制劑。隨后實驗發(fā)現Hoechst33342可明顯抑制人乳腺癌細胞系MCF7和人卵巢癌細胞系SKOV-3中非sP細胞的克隆形成能力[27],并且sP細胞的克隆形成率也明顯低于未經流式分選和未經Hoechst33342染料染色的細胞;分選出的sP細胞,與Non-sP細胞相比,具有更強的外排 Hoechst33342染料的能力,表明sP細胞所受 Hoechst33342染料帶來潛在的毒副反應要小,對實驗結果會產生一定的干擾。Szotek等[17]報道 Hoechst33342染料濃度的高低對 sP細胞不同周期含量的影響和對ABCG2/bcrp1蛋白的表達的差異。故sP細胞和Non-sP細胞成瘤能力的不同很可能是由 Hoechst33342的毒性作用造成的假象,而非真正的干細胞特性的差異引起的。是否存在sP細胞因具有膜轉運能力而受到保護,而Non-sP細胞因得不到這種保護而被細胞毒性傷害,可能因此無法成瘤的這一觀點,仍需通過今后大量的實驗去證實。

通過近幾年的實驗研究結果表明,大多數腫瘤細胞系或異體移植腫瘤中sP細胞群體數目都較少,不能完全排除在一定程度上對檢測可靠性的影響。不同實驗室sP細胞群體“設門”各異,在很大程度上,從sP細胞群體中區(qū)分Non-sP細胞成分取決于人為因素且變化很大。而且sP細胞群體證實具有明顯的異質性,腫瘤干細胞樣細胞只是部分而非專一地富集于sP細胞群體。Patrawala等[22]在活體注射高數目的非sP腫瘤細胞時發(fā)現其也能導致腫瘤發(fā)生;高致瘤性的前列腺腫瘤細胞系PPC-1中sP細胞難以檢測;另外,在低致瘤性的乳腺癌細胞系MCF7容易發(fā)現sP細胞,高致瘤性的M DA-M B231和MDAMB435卻檢測不到?？赡苡捎诓缓侠淼呐囵B(yǎng)條件或者缺少可定義的干細胞樣群體,許多腫瘤還未能證實sP細胞的存在。

不同實驗室采用sP細胞分選法研究同種類型腫瘤的腫瘤干細胞,在針對同一細胞株情況下,實驗結果有時也存在較大偏差,缺乏很好的可比性。因此需要進一步摸索sP細胞的分離和純化條件,建立合適的流式參數,確定Hoechst33342濃度和毒理曲線,只有這樣才能更加科學地比較不同實驗室分析的實驗結果,去深入研究卵巢癌腫瘤干細胞與sP細胞之間的關系。

5 結 語

目前的實驗研究已經證實sP細胞廣泛分布于各種組織、器官及多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中,而且具有明確的表型標記和分離方法,并富含干細胞樣細胞。但通過對之前大量文獻研究結果的回顧,該方法也有其自身的局限性;另一方面也不能不正視sP表型與腫瘤干細胞特異性分子表型之間的差異性。已有大量文獻給出足夠的證據證實二者之間具有一致性,但也另有一些實驗結果證實二者之間存在差異性。

腫瘤干細胞表型標記了解有限,缺乏已知統(tǒng)一的特異性標記,因此腫瘤干細胞的分離純化一直成為研究的難點。而sP細胞與相應組織來源的腫瘤干細胞有相似之處,具有干細胞樣特性,因此sP細胞分選法仍不失為一種分離腫瘤干細胞有效的實驗方法。目前在卵巢癌sP細胞的實驗中僅局限在永生化的細胞株,有些報道從卵巢癌患者腹水中、卵巢癌組織中原代培養(yǎng)鑒定出sP細胞,但sP細胞的含量與腫瘤分化程度有無相關性的報道至今未見。而且在有些細胞株中并未檢測出sP細胞,因此將sP細胞作為卵巢癌干細胞的一種特殊細胞亞群,還是作為卵巢癌干細胞的sP表型,是否是卵巢癌腫瘤復發(fā)和轉移的根源,能否作為卵巢癌的篩選以及sP細胞的 ABCG2/Bcrpl耐藥蛋白特性,還有待于今后大量實驗證實。相信隨著深入研究,sP細胞分選法不僅解決研究腫瘤干細胞中的干細胞來源問題,對推動腫瘤干細胞的研究和發(fā)展具有重要意義,也為腫瘤臨床靶向性治療提供新的思路和策略。

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