李燕利 胡春祥 高佳

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

分月扇舟蛾(Clostera anastomosis L.)屬鱗翅目，舟蛾科，是我國廣大林區(qū)常發(fā)生的一種林木蟲害。全國各地林區(qū)均有發(fā)生，在東北地區(qū)的闊葉次生林及人工林內(nèi)較為常見。主要危害山楊及其它楊、柳類樹木。近幾年，分月扇舟蛾蟲害屢有發(fā)生，且危害嚴(yán)重［1］，常大面積爆發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重影響樹木的生長和生態(tài)效益的發(fā)揮［2］。

Bt是一種對(duì)人畜安全、無環(huán)境污染的微生物殺蟲劑，在農(nóng)、林害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用［3］。關(guān)于Bt殺蟲蛋白對(duì)昆蟲的作用機(jī)制大多數(shù)研究主要集中在昆蟲組織病理學(xué)觀察和殺蟲蛋白與中腸上皮細(xì)胞膜之間的結(jié)合作用上，對(duì)昆蟲的保護(hù)酶活性影響的研究報(bào)道則相對(duì)較少。保護(hù)酶是昆蟲體內(nèi)最主要的三大酶系之一，已有報(bào)道證實(shí)Bt引起昆蟲的保護(hù)酶系變化［4－5］。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)是生物體內(nèi)普遍存在的3種防御氧化損傷的重要保護(hù)酶。SOD的作用是把O－2·歧化成H2O2，H2O2能與O－2·形成毒性更強(qiáng)的氫氧自由基(HO·)，但細(xì)胞內(nèi)的CAT可以將H2O2轉(zhuǎn)化成水，生物體內(nèi)的幾種保護(hù)酶處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個(gè)低水平，起到保護(hù)生物機(jī)體的作用［6］。一旦保護(hù)酶系遭到破壞，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧自由基濃度過高，自由基超強(qiáng)的氧化能力將破壞生物功能分子機(jī)制，使細(xì)胞功能受到威脅［7］。國內(nèi)外關(guān)于Bt殺蟲蛋白對(duì)昆蟲的作用機(jī)制大多數(shù)研究主要集中在昆蟲組織病理學(xué)觀察和殺蟲蛋白與中腸上皮細(xì)胞膜之間的結(jié)合作用上，對(duì)昆蟲的保護(hù)酶活性影響的研究只見于轉(zhuǎn)基因作物方面［8－10］，而對(duì)鱗翅目的林業(yè)害蟲保護(hù)酶系影響的研究還未見報(bào)道，因此，本研究從抗氧化防御角度研究Bt對(duì)分月扇舟蛾幼蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響，對(duì)于深入了解Bt對(duì)鱗翅目昆蟲的作用機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

分月扇舟蛾采自黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣新店林場，采后在室內(nèi)飼養(yǎng)1 d，用毛筆挑取齡期大小一致的幼蟲進(jìn)行毒力和酶活力測定。

1.2 毒力測定

采用葉片藥膜法，將Bt粉劑用蒸餾水配成50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng·L－1，以蒸餾水處理作對(duì)照。將未接觸過藥劑的楊樹葉片在稀釋藥液中浸10 s，陰干，用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放入透氣性良好的透明養(yǎng)蟲瓶(直徑9 cm、高14 cm)中。挑選分月扇舟蛾5齡幼蟲接到楊樹葉片上，每瓶放入15頭，重復(fù)4次。置于溫度為(28±0.5)℃，光周期12 h/d的恒溫養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)。每隔1～2 d換1次葉片，換葉片時(shí)把幼蟲的糞便清理干凈，分別于12、24、36、48、72 h后檢查死亡數(shù)。用毛筆輕觸幼蟲，對(duì)刺激物無反應(yīng)者視為死亡。數(shù)據(jù)用POLO軟件處理，計(jì)算LC30、LC50及其95%置信區(qū)間。

1.3 酶活性測定

酶液制備:根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果，選擇48 h的LC30(9 ng·L－1)和LC50(17 ng·L－1)2個(gè)質(zhì)量濃度劑量處理分月扇舟蛾5齡幼蟲，在12、24、48、72 h后取健壯、活潑的幼蟲5頭，加入5 mL 0.05 mol·L－1，pH值7.0預(yù)冷的磷酸緩沖液(含1%PVP、0.04%苯基硫脲和0.01 mol·L－1EDTA)，冰浴下充分勻漿后，于4℃，10 000 r/min下離心15 min，取上清液為待測酶液。

超氧化物歧化酶測定:參考Beauchamp等［11］方法。在試管中加入3 mL反應(yīng)液(含50 mmol·L－1，pH=7.0磷酸緩沖液，13 mmol·L－1甲硫氨酸，10 mmol·L－1EDTA，75 mmol·L－1NBT)和0.01 mL酶液，最后加入0.4 mmol·L－1核黃素0.6 mL，以不加酶液管作為最大光還原管，4 000 lx下光照20 min后，立即避光，迅速測定A560值，以未光照的相同反應(yīng)管為對(duì)照管，50%抑制率所需的酶量為一個(gè)酶活性單位(U)，測定重復(fù)3次，計(jì)算SOD酶活性，酶活力單位以U·min－1·mg－1表示，每處理重復(fù)3次。

過氧化氫酶測定:取30%H2O20.5～0.6 mL，加水至50 mL，從中取出4 mL，加入0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值7.0)26 mL，測定240 nm處1 cm光路OD值，如其OD值在0.50～0.55，即作為過氧化氫酶的底物溶液，取已預(yù)溫至25℃的底物溶液3 mL，在25℃條件下加入粗酶液30 μL，立即用紫外分光光度計(jì)在240 nm下每隔30 s測定一次，記錄2 min。酶活力單位以U·min－1·mg－1表示，每處理重復(fù)3次。

過氧化物酶測定:參考Simon［12］方法。在試管中分別加入0.1 mol·L－1、pH值6.0的磷酸緩沖液1.8 mL，0.1%愈創(chuàng)木酚1 mL，酶液0.05 mL和0.08%H2O21 mL，混勻后，反應(yīng)20 min，以蒸餾水為對(duì)照，于470 nm處測定OD值。酶活力單位為U·min－1·mg－1。

蛋白含量測定:參照Bradford［13］記述的考馬斯亮蘭藍(lán)G－250染色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用POLO軟件計(jì)算Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲的LC30、LC50及95%置信區(qū)間。對(duì)同一質(zhì)量濃度處理下不同時(shí)間對(duì)酶活性影響的差異采用SPSS16.0軟件LSD方法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt對(duì)分月扇舟蛾幼蟲的毒力

Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲的毒力測定結(jié)果如表1所示:LC30和LC50隨著處理時(shí)間的增長而逐漸減小，其中36 h LC30是48 h的2.876倍，72 h LC30是48 h的1.526倍;36 h LC50是48 h的4.539倍，72 h LC50是48 h的1.469倍。說明隨著處理時(shí)間的增加，Bt對(duì)分月扇舟蛾幼蟲的毒力增強(qiáng)。

表1 Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲的毒性

2.2 Bt對(duì)分月扇舟蛾SOD的影響

Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲體內(nèi)SOD的影響見表2。與對(duì)照相比，9 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾體內(nèi)的SOD活性呈平緩的趨勢增加，分別增加了5.8%、10.0%、14.1%、19.9%，但均無顯著差異。這說明較低質(zhì)量濃度的Bt對(duì)分月扇舟蛾體內(nèi)的SOD活性有激活作用，只是隨著處理時(shí)間的增加，對(duì)SOD活性的激活作用不明顯，這可能是較低質(zhì)量濃度的Bt并沒有對(duì)分月扇舟蛾幼蟲造成很大的傷害。17 ng·L－1的Bt處理后，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在48 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.704倍，而后開始下降，但均高于對(duì)照，24、48、72 h表現(xiàn)為差異極顯著(p＜0.01)。說明在處理12～48 h分月扇舟蛾體內(nèi)超氧自由基數(shù)量大增，使SOD活性增加，但是隨著處理時(shí)間的增大，過量的超氧自由基使SOD活性受到抑制，以致在72 h時(shí)，SOD的活性有所降低。SOD酶活性:LC50＞LC30＞CK。Bt質(zhì)量濃度越高，對(duì)SOD酶活性的激活作用越大。而2種處理都在48 h時(shí)達(dá)到最大值，72 h出現(xiàn)下降的趨勢，說明隨處理時(shí)間增長，分月扇舟蛾體內(nèi)積累的Bt抑制了SOD清除體內(nèi)產(chǎn)生的O－2·，因而導(dǎo)致其中毒。

表2 Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲SOD活性的影響

2.3 Bt對(duì)分月扇舟蛾CAT的影響

由表3可見，9 ng·L－1的Bt處理后，CAT活性呈明顯的上升趨勢，并在72 h時(shí)達(dá)到最大值。在48、72 h的CAT活性升高顯著，分別是對(duì)照的1.238、1.307倍，并表現(xiàn)出差異極顯著(p＜0.01)。17 ng·L－1的Bt處理后，各處理時(shí)間的CAT酶活性均略高于對(duì)照但變化平緩，分別比對(duì)照增加了8.4%、8.7%、3.0%、5.6%，只有在處理24 h后，達(dá)到差異顯著(p＜0.01)。

表3 Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲CAT活性的影響

CAT活性高于對(duì)照組，這可能是清除由免疫反應(yīng)產(chǎn)生的大量自由基的需要。9 ng·L－1處理組與17 ng·L－1處理組相比，CAT酶活性增加了，可能是低質(zhì)量濃度的Bt能夠激活CAT，提高了體內(nèi)清除H2O2的能力，而當(dāng)Bt的質(zhì)量濃度過大時(shí)，超過了機(jī)體所能承受的閾值，不能激活CAT，酶活性變化水平不大，不能主動(dòng)清除體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，從而對(duì)分月扇舟蛾產(chǎn)生毒害作用。

2.4 Bt對(duì)分月扇舟蛾P(guān)OD的影響

Bt對(duì)分月扇舟蛾P(guān)OD的影響見表4。取食9 ng·L－1的Bt后，在處理72 h中，分月扇舟蛾體內(nèi)POD活性呈顯著上升的趨勢，且各處理時(shí)間的POD活性與對(duì)照相比，差異均極顯著(p＜0.01)，在各時(shí)間段的酶活性分別是對(duì)照的2.789、3.432、1.277、8.077倍，在72 h時(shí)達(dá)到最高值。取食17 ng·L－1的Bt后，POD活性不斷升高，并均高于對(duì)照，在處理12、24 h時(shí)POD活性呈平緩的上升趨勢，而在48、72 h時(shí)有顯著升高，并表現(xiàn)出差異極顯著(p＜0.01)，分別是對(duì)照的3.014、3.165倍。

POD主要作用是清除生物體內(nèi)代謝后期的有害物質(zhì)。由此可見，隨著取食時(shí)間的推移，分月扇舟蛾體內(nèi)的POD顯著升高，說明其抵抗Bt脅迫的能力強(qiáng)，能夠提高自身體內(nèi)的POD活性以清除體內(nèi)過量的H2O2，維持細(xì)胞內(nèi)H2O2的平衡，從而適應(yīng)外界環(huán)境。

表4 Bt對(duì)分月扇舟蛾5齡幼蟲POD活性的影響

3 結(jié)論與討論

昆蟲保護(hù)酶系活性與殺蟲劑、昆蟲病毒、微孢子蟲等外界刺激物的強(qiáng)度及昆蟲耐藥性和抗逆性等相關(guān)［6，14－16］。研究表明，昆蟲體內(nèi)存在著超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等保護(hù)酶系統(tǒng)，在昆蟲各種生理作用或生化反應(yīng)過程中起著清除氧自由基、保護(hù)昆蟲機(jī)體免受損傷的重要作用［17］。本研究中分月扇舟蛾幼蟲取食不同質(zhì)量濃度Bt處理的楊樹葉片后，體內(nèi)保護(hù)酶活性的增加，可以認(rèn)為是一種保護(hù)性的反應(yīng)，保護(hù)酶活性的增加意味著清除自由基的能力加強(qiáng)，即表現(xiàn)出一定的抗逆性能力。分月扇舟蛾幼蟲取食不同質(zhì)量濃度Bt后體內(nèi)保護(hù)酶活性受到誘導(dǎo)增加和國內(nèi)很多研究結(jié)果類似。郭建英等［10］研究甜菜夜蛾幼蟲取食Bt棉后，體內(nèi)總超氧化物酶活力顯著高于取食常規(guī)棉相同時(shí)間的個(gè)體。申繼忠等［18］報(bào)道大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲取食蘇云金桿菌后SOD的活性顯著升高;Ding Shuangyang等［8］研究了轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populus nigra)和轉(zhuǎn)CpTI基因毛白楊(P.tomentosa×P.bolleana)×P.tomentosa對(duì)美國白蛾(Hyphantria cunea)幼蟲中腸保護(hù)酶(SOD、CAT和POD)活性的影響，結(jié)果表明害蟲取食轉(zhuǎn)基因楊樹后，中腸SOD、CAT和POD在飼喂數(shù)小時(shí)內(nèi)均逐漸增加，在某一時(shí)刻達(dá)到最高值后突然下降。郭同斌等［9］研究了轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)楊小舟蛾體內(nèi)3種保護(hù)酶活力的影響，結(jié)果顯示幼蟲中腸SOD活力顯著升高，而CAT和POD活力受到了顯著抑制。

分月扇舟蛾幼蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性增加是一種保護(hù)性的反應(yīng)，但3種酶活在不同的劑量水平體現(xiàn)出的活性變化并不一致。9 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾幼蟲體內(nèi)SOD活性無明顯變化趨勢，而CAT和POD活性呈顯著上升趨勢，可能是分月扇舟蛾幼蟲體內(nèi)SOD對(duì)低質(zhì)量濃度Bt的脅迫不敏感，而CAT和POD較為敏感。CAT和POD活性的增大可以加速清除體內(nèi)積累過多的自由基以減少對(duì)分月扇舟蛾的傷害。17 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾幼蟲體內(nèi)在短時(shí)間內(nèi)積累大量的超氧陰離子自由基(O－2)，誘導(dǎo)SOD活性在12～48h明顯升高，將過多的超氧陰離子自由基(O－2)轉(zhuǎn)化成H2O2，進(jìn)而誘導(dǎo)了CAT和POD的活性增大來清除體內(nèi)過多的H2O2，而在72 h時(shí)，SOD的活性受到抑制，這可能是由于H2O2在體內(nèi)的大量積累，導(dǎo)致H2O2與O－2·形成毒性更強(qiáng)的氫氧自由基(HO·)，破壞了細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)，使分月扇舟蛾中毒。

藥劑處理對(duì)昆蟲活性氧代謝系統(tǒng)造成的影響是很復(fù)雜的，采用不同劑量可能會(huì)得到不同的結(jié)果。在正常狀況下分月扇舟蛾體內(nèi)SOD、CAT和POD協(xié)調(diào)一致、處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使得自由基處于一個(gè)低水平。當(dāng)分月扇舟蛾受到低質(zhì)量濃度的Bt脅迫時(shí)，SOD活性變化不顯著，可能此階段尚未產(chǎn)生過多的活性氧來激活SOD，而CAT和POD活性的增大可以清除體內(nèi)積累的自由基，以減少對(duì)分月扇舟蛾的傷害，這說明低質(zhì)量濃度Bt處理時(shí)，分月扇舟蛾體內(nèi)3種保護(hù)酶處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個(gè)低水平［6］;高質(zhì)量濃度Bt的脅迫，SOD活性顯著升高但在48 h達(dá)到最大值后下降，說明高質(zhì)量濃度的Bt處理在短時(shí)間內(nèi)激活了SOD活性，將過多的超氧陰離子自由基(O－2)轉(zhuǎn)化成H2O2，而CAT活性增加趨勢不明顯，POD也只在48、72 h時(shí)有顯著升高，不能及時(shí)清除大量的H2O2，而導(dǎo)致過高濃度的H2O2在48 h達(dá)到最大值后開始抑制SOD的活性，說明高質(zhì)量濃度Bt處理使得分月扇舟蛾體內(nèi)3種保護(hù)酶表現(xiàn)出不同的增降趨勢，破壞了3種酶的平衡關(guān)系，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基水平過高對(duì)蟲體產(chǎn)生了不可恢復(fù)的毒害作用［7］。

［1］蘇元吉，高玉梅.分月扇舟蛾發(fā)生特點(diǎn)及防治探析［J］.林業(yè)科技情報(bào)，2009，41(3):8－9.

［2］王福維，牛延章，侯麗偉，等.分月扇舟蛾生物學(xué)特性及其防治研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，1998，11(3):325－329.

［3］譚聲江，陳曉峰，李典謨.昆蟲對(duì)Bt毒素的抗性機(jī)理研究進(jìn)展［J］.昆蟲知識(shí)，2001，38(1):12－17.

［4］徐艷聆，王振營，何康來，等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米對(duì)亞洲玉米螟幼蟲幾種主要酶系活性的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2006，49(4):562－567.

［5］張巍，張志罡，付秀芹，等.轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)三種保護(hù)酶活性的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51(10):1022－1027.

［6］李周直，沈惠娟，蔣巧根，等.幾種昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活力的研究［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1994，37(4):399－403.

［7］張慧，王曉容，匡石滋，等.斜紋夜蛾核型多角體病毒與兩種亞致死劑量的農(nóng)藥混用對(duì)斜紋夜蛾體內(nèi)三種抗氧化酶活性的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2006，49(5):775－779.

［8］Ding Shuangyang，Li Huaiye，Li Xuefeng，et al.Effects of two kinds of transgenic poplar on protective enzymes system in the midgut of larvae of American white moth［J］.Journal of Forestry Research，2001，12(2):119－122.

［9］郭同斌，嵇保中，蔣繼宏，等.轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)楊小舟蛾體內(nèi)三種保護(hù)酶活力的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2006，49(3):381－386.

［10］郭建英，吳剛，萬方浩.甜菜夜蛾體內(nèi)代謝耐受性對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉響應(yīng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)［J］.中國科學(xué)C輯:生命科學(xué)，2009，39(10):940－947.

［11］Beauchamp C，F(xiàn)ridovich I.Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］.Analytical Biochemistry，1971，44(1):276－287.

［12］Simon L M，F(xiàn)atrai Z，Jonas D E，et al.Study of peroxide metabolism enzymes during the development of phaseolus vulgris［J］.Biochemistry Physiology，1974，166:387－392.

［13］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(1/2):248－254.

［14］蔣志勝，尚稚珍，萬樹青，等.光活化殺蟲劑α－三噻吩的電子自旋共振分析及其對(duì)庫蚊保護(hù)酶系統(tǒng)活性的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2003，46(1):22－26.

［15］Wang Ying，Oberley L W，Murhammer D W.Evidence of oxidative stress following the viral infection of two Lepidopteran insect cell lines［J］.Free Radical Biology and Medicine，2001，31(11):1448－1455.

［16］Lozinskaya Y L，Slepneva I A，KhramtsovV V，et al.Changes of the antioxidant status and system of generation of free radicals in hemolymph of Galleria mellonella larvae at microsporidiosis［J］.Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology，2004，40(2):119－125.

［17］王滿囷，李周直.滯育期間鞭角華扁葉蜂保護(hù)酶系統(tǒng)活力［J］.林業(yè)科學(xué)，2002.38(4):100－104.

［18］申繼忠，錢傳范.亞致死劑量蘇云金桿菌蠟螟亞種對(duì)大蠟螟幼蟲SOD和POX活性的影響［J］.生物防治通報(bào)，1994，10(3):118－122.