邵陽 劉秋 胡英暢 閆建芳 齊小輝

(大連民族學(xué)院，大連，116600)

小葉黃楊(Buxus microphylla)是城市綠化的重要樹種之一［1］，原產(chǎn)我國西南、華中及福建、浙江、江蘇各省，現(xiàn)在各地都有栽培。隨著綠化環(huán)境中應(yīng)用面積的逐步擴(kuò)大，小葉黃楊的感病率也在逐年增加。某些地區(qū)小葉黃楊大面積枯死，已嚴(yán)重限制其在各種環(huán)境綠化中的應(yīng)用。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物工程課題組從小葉黃楊上分離到一種葉斑病病原菌，該菌引起小葉黃楊早期葉片脫落，繼而造成小葉黃楊莖斑成叢而死亡，嚴(yán)重危害小葉黃楊的生長。尤其在中國東北地區(qū)，該病害普遍流行。葉斑病是甜瓜重要病害之一，全國各地都有發(fā)生，也可引起黃瓜、冬瓜、絲瓜、苦瓜等蔬菜的病害，并已引起人們的重視，但目前對(duì)小葉黃楊葉斑病類病害的研究非常少。筆者研究小葉黃楊葉斑病致病菌生物學(xué)特性及不同藥劑藥效，明確小葉黃楊葉斑病菌的生物學(xué)特性以及生產(chǎn)上常用藥劑的抑菌效果，以期為生產(chǎn)上該病害的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試病菌標(biāo)樣的采集、分離及鑒定

小葉黃楊葉斑病病葉采自大連市開發(fā)區(qū)和沈陽市東陵區(qū)，采用葉片組織常規(guī)分離方法，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得病菌的純培養(yǎng)后，接種經(jīng)冷凍處理的小葉黃楊健康植株，經(jīng)致病性驗(yàn)證后保存于大連民族學(xué)院微生物工程研究室。同時(shí)對(duì)小葉黃楊葉斑病病原菌進(jìn)行形態(tài)觀察及ITS序列分析，ITS序列擴(kuò)增引物為:ITS1，5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3');ITS4，5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')［2］。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、Czapek’s培養(yǎng)基［3］。

1.2 病菌生物學(xué)特性測(cè)定

不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長的影響:采用不用碳源，即葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉依次等量替換Czapek’s培養(yǎng)基中的蔗糖進(jìn)行碳源試驗(yàn);不同氮源即硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、天門冬酰胺依次等量替換培養(yǎng)基中的硝酸鉀進(jìn)行氮源試驗(yàn)。將直徑為3 mm的病原菌菌餅分別轉(zhuǎn)接到含不同碳源、氮源的平板培養(yǎng)基上，每一處理重復(fù)3次，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑［4］。

不同碳源對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響:以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露聚糖為碳源分別配制0.1%和0.2%的糖溶液，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)20 h，以清水作對(duì)照，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，每一處理重復(fù)3次。

pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響:滅菌后的PDA培養(yǎng)基在無菌條件下，用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，分別將培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為3、4、5、6、6.5、7、8、9、10、11共10個(gè)pH值梯度。將病菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3次重復(fù)，在20℃恒溫條件下培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

光照對(duì)病原菌的影響:設(shè)置連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、黑暗和光照各12 h交替3個(gè)處理。病原菌轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，在上述條件下25℃恒溫培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3 殺菌劑抑菌效果測(cè)定

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別加入不同質(zhì)量濃度的50%福美雙、50%撲海因、70%代森錳鋅、70%甲基托布津、50%速克靈、50%農(nóng)利靈、50%特富靈、20%斷灰、50%翠貝、40%福星、72%克露共11種殺菌劑化學(xué)農(nóng)藥，將病原菌轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基上，在25℃下恒溫培養(yǎng)5 d測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算EC50［5］。菌絲生長抑制率=［(對(duì)照菌落直徑－處理菌落生長直徑)/對(duì)照菌落直徑］×100%。以殺菌劑質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)為X軸，以抑制機(jī)率為Y軸，做散點(diǎn)圖，求得直線回歸方程，計(jì)算出EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉黃楊葉斑病菌病原鑒定

Phoma和Phyllosticta2屬間的分類一直存在許多爭(zhēng)議。自Phoma和Phyllosticta2屬建立以來，主要依據(jù)Saccardo的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分屬，2屬的分生孢子器和分生孢子的形態(tài)、色澤、大小均極相似［6］。Van der Aa等［7］報(bào)道，Phyllosticta屬的分生孢子產(chǎn)生尾狀非細(xì)胞附屬物，同時(shí)，根據(jù)該附屬物的長短、分生孢子及分生孢子器形態(tài)對(duì)Phyllosticta屬下種進(jìn)行分類。本研究分離的小葉黃楊葉斑病病原菌生長緩慢，20 d菌落直徑為50 mm，形成圓形或近圓形菌落，墨綠色至深橄欖色。分生孢子器球形或亞球形，埋生或半埋生，直徑175～220 μm，高120～150 μm，壁厚15～20 μm，單生，褐色至黑褐色，有孔口，偶爾略突起呈喙?fàn)?圖1)。產(chǎn)孢細(xì)胞卵圓形、燒瓶狀或短圓柱形，無色單細(xì)胞。分生孢子橢圓形或卵圓形，無色，大小(10.0～12.5)μm×(7.5～10.0)μm，平均值為11.5 μm×7.88 μm，分生孢子長寬比為1.41，具一根不分支、纖弱的黏液狀附屬物，長12.5～45.0 μm(圖2)。對(duì)小葉黃楊葉斑病病原菌的ITS序列分析表明，該病原菌為Phyllosticta spinarum(圖3)。GeneBank登錄號(hào)為EU275150。

圖1 小葉黃楊葉斑病病原菌分生孢子器的形態(tài)

圖2 小葉黃楊葉斑病病原菌分生孢子的形態(tài)

2.2 不同碳源、氮源對(duì)病菌生長的影響

在含有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露聚糖5種不同碳源的培養(yǎng)基中，小葉黃楊葉斑病菌菌落直徑分別為66.3、68.9、59.1、56.2、54.3 mm。其中乳糖生長最為緩慢，氣生菌絲稀疏。在含葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的培養(yǎng)基中氣生菌絲均為白色，基生菌絲為乳白色，其中麥芽糖生長最好，擴(kuò)展速度較快。在含有硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、天門冬酰胺5種氮源的培養(yǎng)基中，有機(jī)氮源天門冬酰胺生長最好，菌落直徑為58.9 mm，菌絲茂盛，呈白色。硝酸鉀的生長情況次之，菌落直徑為55.1 mm。病原菌利用氯化銨最差，菌落直徑只有14.3 mm，氣生菌絲擴(kuò)展較慢并且只在菌片上生長。天門冬酰胺的基生菌絲茂盛，中心呈褐色。硝酸鉀次之，基絲呈乳黃色。

圖3 菌株YC06 rDNAITS序列分析聚類結(jié)果

2.3 不同碳源對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響

以清水為對(duì)照的5種碳源對(duì)病原菌孢子萌發(fā)影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，0.2%蔗糖溶液為病原菌孢子萌發(fā)的最佳碳源，0.2%麥芽糖溶液次之，而在清水中，孢子幾乎不萌發(fā)。

2.4 pH值對(duì)病原菌生長的影響

不同pH值對(duì)病原菌生長的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌在pH值3～11時(shí)均生長良好，差別不明顯。說明該菌適宜生長的pH值范圍廣泛。其中在pH=5.5的條件下，生長略好。菌落的氣生菌絲、基絲生長茂盛，基絲均為墨綠色，產(chǎn)生分生孢子器。

2.5 光照對(duì)病原菌的影響

在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、黑暗和光照各12 h交替3種條件下菌落直徑分別為74.8、56.5、69.7 mm，說明該菌種在光照條件下生長能力強(qiáng)于其它條件。

2.6 殺菌劑對(duì)病原菌生長的影響

比較11種殺菌劑的EC50，25%斷灰對(duì)病原菌的抑制效果最好，其EC50為0.000 30 μg。50%特富靈次之，其EC50為0.00056 μg。50%翠貝和72%克露對(duì)病原菌的抑制效果最差(表3)。

表3 殺菌劑對(duì)病原菌的抑菌效果

3 結(jié)論與討論

小葉黃楊葉斑病菌菌絲生長的最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為天門冬酰胺。在20～25℃下、各種pH值條件下以及光照條件下菌絲生長良好。在25℃下小葉黃楊葉斑病原菌在0.2%蔗糖溶液中孢子發(fā)芽率最高。通過對(duì)11種農(nóng)藥的EC50的比較，20%斷灰對(duì)病原菌抑制效果最好，50%特富靈次之。斷灰農(nóng)藥通用名稱為嘧霉胺，屬于苯胺基嘧啶類殺菌劑，為當(dāng)前防治灰霉病活性較好的殺菌劑。其作用機(jī)理是通過抑制病菌浸染酶的產(chǎn)生從而阻止病菌的侵染并殺死病菌。特富靈為三氟咔唑類殺菌劑，其作用機(jī)理為麥角甾醇生物合成抑制劑。最初用于麥類、果樹、蔬菜等白粉病、銹病的防治。二者均為新型低毒性殺菌劑，可作為防治小葉黃楊葉斑病的首選藥物。在8類殺菌劑中，取代脲類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對(duì)該病原菌的抑菌效果均不明顯。而在2種有機(jī)硫殺菌劑中，雖然福美雙的抑菌效果較好，但由于其毒性，福美雙已被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織限制使用，因此，建議不采用福美雙進(jìn)行該病害的防治。二甲酰亞胺類殺菌劑的速克靈和撲海因，以及有機(jī)硅殺菌劑福星可作為防治該病害的使用的備選農(nóng)藥。

葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)是球殼孢目中的重要屬，其中很多種是引起植物葉、莖和根部病害的重要病原菌，能引起葉斑、莖枯、根腐、果腐或穎枯等癥狀，常造成植物早期落葉和腐爛［7］。目前國內(nèi)外關(guān)于葉點(diǎn)霉屬對(duì)小葉黃楊危害的研究較少，但近年來由該病原菌引起小葉黃楊葉斑、莖枯乃至成叢死亡的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。筆者在致病性測(cè)定過程中，發(fā)現(xiàn)凍傷更易接種成功，這和東北寒冷地區(qū)，小葉黃楊葉斑病發(fā)病嚴(yán)重的現(xiàn)象相吻合，即小葉黃楊受到凍傷，將加劇該病害的發(fā)生。目前，隨著人們綠化意識(shí)逐步增強(qiáng)，小葉黃楊的利用將更加廣泛，所以及早開展小葉黃楊葉斑病的防治是有必要的，筆者的研究結(jié)果將為生產(chǎn)上該病害的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

［1］杜鳳國，于曉光，呂偉偉，等.小葉黃楊抗寒性的初步研究［J］.北方園藝，2011(2):98－100.

［2］刑曉科，郭順星.從ITS序列探討豬苓與其伴生菌的親緣關(guān)系［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(2):34－36.

［3］方中達(dá).植病研究法［M］.3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:46－50.

［4］王樹和，許曉利，郭巖，等.4種殺菌劑對(duì)八仙花葉點(diǎn)霉菌的毒力測(cè)定［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(9):91－92.

［5］慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1994:79－81.

［6］于莉，鮑文杰，張英，等.Phoma和Phyllosticta兩屬分類的研究進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17(4):102－107.

［7］Van der Aa H A，Vanev S.A revision of the species described in Phyllosticta［M］.Utrecht:Centraalbureau voor Schimmelcultures，2002.