張含國(guó) 張磊

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

朱航勇

(七臺(tái)河市園林管理局)

徐悅麗姚宇

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

落葉松(Larix)是一些生長(zhǎng)快、木材用途廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的樹種。長(zhǎng)白落葉松(Larix Olgensis)、興安落葉松(L.gmelini)和日本落葉松(L.Kaempferi)分別具有不同的優(yōu)良性狀:興安和長(zhǎng)白落葉松具有良好的耐寒性，日本落葉松生長(zhǎng)迅速且不易感染早期落葉病，其雜交種多數(shù)具有雙親的優(yōu)良性狀。但不同的組合雜種優(yōu)勢(shì)存在較大差異，遺傳增益差別很大［1－2］，所以對(duì)雜種落葉松類別的鑒定十分必要。雖然從形態(tài)標(biāo)記［3］、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記［4］和生化標(biāo)記［5］等方面有關(guān)于落葉松種間的鑒別，但因局限性所致影響了其使用。由于從分子水平對(duì)家系間鑒別的研究很少，因而，對(duì)于主要靠有性繁殖的樹種來(lái)說(shuō)，優(yōu)良家系(雜種)的鑒別必不可少。自1994年加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等［6］發(fā)展了ISSR標(biāo)記以來(lái)，因其在分析和應(yīng)用上比RFLP、AFLP和SSR更加簡(jiǎn)便、快捷，而且又能比RAPD揭示出更多的多態(tài)性，現(xiàn)已在各種植物及林木的遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等研究方面得到了廣泛應(yīng)用，例如分析物種親緣關(guān)系［7－8］、遺傳作圖［9］或者與其它分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行相關(guān)分析［10］等。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究日本落葉松、興安落葉松和長(zhǎng)白落葉松及其子代的特異性，試圖找出適合的引物，通過(guò)不同雜種擴(kuò)增條帶的差異，得到雜種和家系的鑒定方法，并根據(jù)遺傳距離對(duì)雜種家系進(jìn)行聚類分析，希望能夠?yàn)椴煌s種的準(zhǔn)確鑒別提供新的途徑和手段。

1 材料與方法

材料來(lái)源——試驗(yàn)材料來(lái)源于黑龍江省牡丹江市林口縣青山林場(chǎng)的落葉松種子園子代測(cè)定林。材料包括生長(zhǎng)性狀優(yōu)良的不同家系:興安落葉松×日本落葉松5個(gè)，興安落葉松×長(zhǎng)白落葉松2個(gè)，日本落葉松×興安落葉松8個(gè)，日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松5個(gè)，共計(jì)20個(gè)家系，單株241個(gè)。材料具體名稱及數(shù)量見表1。采樣時(shí)采取當(dāng)年生嫩葉(松針)，置于冰上保存帶回，之后在冰箱中－40℃保存，以備提取樣本DNA。

植物基因組DNA提取——采用CTAB法提取植物總DNA，將用液氮研磨好的樣品加入CTAB中，65℃水浴后使用氯仿異戊醇抽提，無(wú)水乙醇清洗沉淀，最后將沉淀溶于適量TE中［11］。

反應(yīng)體系和程序——落葉松ISSR反應(yīng)體系為:DNTP(2.5 mmol/L)1.4 μL，Buffer2 μL，Mg2+(2.5 mmol/L)0.4 μL，引物2 μL，Tag酶0.2 μL，DNA模板2 μL。去離子水12 μL，總體積共20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35次循環(huán)，包括94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，最后72℃總延伸7 min［12］。

擴(kuò)增產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳分離，最后在紫外燈下用GENE GENIUS攝像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

表1 家系名稱及子代個(gè)數(shù)

數(shù)據(jù)分析——對(duì)所有引物擴(kuò)增的電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物相同電泳遷移位置條帶的有無(wú)，建立分子標(biāo)記資料(多態(tài)性片段的數(shù)目、大小和信息量)的0、1數(shù)據(jù)。有帶記為1，無(wú)帶或模糊不清的條帶記為0。用所有引物重復(fù)擴(kuò)增1～2次，選擇條帶清晰穩(wěn)定、重復(fù)性好的擴(kuò)增產(chǎn)物統(tǒng)計(jì)相對(duì)分子量大小，記錄結(jié)果。采用Popgen32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算家系間的遺傳距離，再以非加權(quán)兩兩對(duì)比法(Unweighted pair group methods of arithmetic(average)，UPGMA)［13］建立聚類圖。

后期驗(yàn)證——在取材地點(diǎn)隨機(jī)采集落葉松種及雜種的針葉，提取DNA，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)室已有的樣品一起用已篩選的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后記錄電泳圖片的數(shù)據(jù)，根據(jù)已有結(jié)果分析得出每個(gè)樣品的種類，最后與實(shí)際結(jié)果比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR分子標(biāo)記的鑒別

在落葉松種間及無(wú)性系間能夠用特異擴(kuò)增條帶進(jìn)行鑒別的基礎(chǔ)上［11］，進(jìn)一步進(jìn)行雜種子代與親本、不同雜種組合間、雙親之一相同家系、正反交家系的鑒別。

引物編號(hào)及序列具體見表2。

表2 引物編號(hào)及堿基序列

2.1.1 不同雜種組合間鑒定

日本落葉松、興安落葉松和長(zhǎng)白落葉松為父本和母本相互雜交，得到4種不同的雜種落葉松，分別為日×興、日×長(zhǎng)、興×日、興×長(zhǎng)。利用篩選好的ISSR引物對(duì)這4種不同的雜種落葉松進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):日×興和興×日的雜種落葉松很難區(qū)分，而日×長(zhǎng)和興×長(zhǎng)雜交的子代可以通過(guò)擴(kuò)增條帶的特異性與其他雜種落葉松區(qū)別。

利用49個(gè)ISSR引物對(duì)不同雜種進(jìn)行擴(kuò)增，分析比較電泳圖片后發(fā)現(xiàn):16號(hào)ISSR引物可以鑒定興安落葉松×長(zhǎng)白落葉松。興×長(zhǎng)的子代在16號(hào)引物擴(kuò)增的條件下，在相對(duì)分子質(zhì)量1 500 bp處擴(kuò)增出特異譜帶，其它日×興、日×長(zhǎng)和興×日的子代在這一位置均沒(méi)有出現(xiàn)譜帶(圖1)。

1 ～7.日本落葉松×興安落葉松;8～12.日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松;13～18.興安落葉松×日本落葉松;19～24.興安落葉松×長(zhǎng)白落葉松;M.DL 2000 Marker。

19 號(hào)ISSR引物可以鑒定日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松。日×興、興×日和興×長(zhǎng)的子代在相對(duì)分子質(zhì)量900 bp處均有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，而日×長(zhǎng)白落葉松雜交的子代在19號(hào)引物的擴(kuò)增下，在相同標(biāo)準(zhǔn)片斷處沒(méi)有任何擴(kuò)增譜帶(圖2)。

圖1 16號(hào)引物對(duì)不同雜交組合的擴(kuò)增結(jié)果

1 ～7.日本落葉松×興安落葉松;8～12.日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松;13～18.興安落葉松×日本落葉松;19～23.興安落葉松×長(zhǎng)白落葉松;M.DL 2000 Marker。

2.1.2 雙親之一相同、家系不同的鑒定

試驗(yàn)材料中有涉及雙親之一相同的不同家系。以日5為父本、母本不同的家系2個(gè)，以日3為母本、父本不同的家系3個(gè)。

日5為父本、母本分別為興6和興12的2個(gè)不同家系，在38號(hào)ISSR引物的擴(kuò)增下共出現(xiàn)6條擴(kuò)增譜帶。其中，在標(biāo)準(zhǔn)片段700 bp處，2個(gè)家系的子代擴(kuò)增條帶出現(xiàn)的幾率有所不同。興6×日5的子代(圖3)出現(xiàn)擴(kuò)增譜帶的幾率是88.89%，興12×日5的子代(圖4)在此處擴(kuò)增出譜帶的幾率為10%。

圖2 19號(hào)引物對(duì)不同雜交組合的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 38號(hào)引物對(duì)興6、日5及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 38號(hào)引物對(duì)興12、日5及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果表明，在已知父本為日5、而母本不確定時(shí)，用38號(hào)引物對(duì)子代樣品進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)700 bp擴(kuò)增譜帶的有無(wú)可判斷家系的母本是哪個(gè)個(gè)體，如出現(xiàn)擴(kuò)增譜帶，則樣品的母本為興6的可能性大于其母本為興12的可能性，其母本為興6的可能性為89.89%，其母本為興12的可能性為10.11%。如沒(méi)有擴(kuò)增譜帶出現(xiàn)，則情況相反，其母本為興6的可能性為10.99%，其母本為興12的可能性為89.01%。

同樣，在引物ISSR36的擴(kuò)增下，以日3為母本，父本分別為興2、興8和興9的3個(gè)不同家系的子代擴(kuò)增出相對(duì)分子質(zhì)量700 bp片段的幾率有所不同。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 日3為母本，父本不同的家系利用ISSR36擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 正反交家系的鑒定

試驗(yàn)材料中有由父母雙親正反交所產(chǎn)生的不同家系，在對(duì)這些家系的電泳圖片比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同ISSR引物的擴(kuò)增下，有2對(duì)正反交組合可以進(jìn)行區(qū)分。其中所涉及的4個(gè)家系每個(gè)家系各包括10個(gè)子代。

在用36號(hào)ISSR引物對(duì)由日5和興12正反交所產(chǎn)生的不同的家系進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，子代在400 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，而父本和母本均沒(méi)有，其中興12×日5的子代出現(xiàn)此片段的特異率達(dá)到了100%，而日5×興12的子代出現(xiàn)此片段的特異率也達(dá)到90%(圖5、圖6)。并且，在相對(duì)分子質(zhì)量700 bp處，興12×日5的子代在相同位置只有20%擴(kuò)增出顏色非常淺的條帶，可以忽略不計(jì)(圖5)，而日5×興12的子代有80%擴(kuò)增出條帶(圖6)。這可以說(shuō)明，當(dāng)已知樣品為日5和興12雜交所得，但不確定父母本時(shí)，用36號(hào)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可以在700 bp處擴(kuò)增出條帶的一定為日5×興12的子代;反之，如在此位置沒(méi)有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)時(shí)，則樣品為興12×日5的可能性為71.42%。

圖5 36號(hào)引物對(duì)興12、日5及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

圖6 36號(hào)引物對(duì)日5、興12及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

在用32號(hào)ISSR引物對(duì)由日5和興6正反交所產(chǎn)生的不同的家系進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，日5×興6的子代在相對(duì)分子質(zhì)量350 bp處有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，比率達(dá)到90%(圖7)，而興6×日5的子代在此位置除1個(gè)子代外，其余均沒(méi)有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(圖8)。結(jié)果表明:當(dāng)用32號(hào)引物對(duì)已知為日5和興12雜交所得的子代進(jìn)行擴(kuò)增，但不確定父母雙親時(shí)，如果有350 bp擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，則樣品是日5×興6的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于是興6×日5的子代，且其母本為日5的可能性為81.82%。

圖7 32號(hào)引物對(duì)日5、興6及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

圖8 32號(hào)引物對(duì)興6、日5及其雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳距離分析與雜種鑒別

以子代個(gè)體數(shù)相同的20個(gè)家系的遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，其遺傳距離的變幅及平均值分別為0.0161～0.4989和0.2642(表4、表5)。遺傳距離最小的是日5×長(zhǎng)77－1和日5×長(zhǎng)77－3家系，遺傳距離最大的是日3×興9和興9×日76－2家系。

表4 遺傳距離分析中家系代號(hào)

利用軟件繪制遺傳關(guān)系聚類圖。從家系間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖9)可以看出，在0.4的遺傳距離上，可以將20個(gè)家系分為4類，分別是4種不同的雜交組合，即:日本落葉松×興安落葉松、日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松、興安落葉松×長(zhǎng)白落葉松和興安落葉松×日本落葉松。遺傳距離的分類說(shuō)明，不同落葉松雜種是可以進(jìn)行區(qū)分的，與分子標(biāo)記得到的結(jié)果基本吻合。

圖9 家系間遺傳關(guān)系聚類圖

表5 20個(gè)家系的遺傳一致度和遺傳距離

3 討論

目前，利用分子標(biāo)記的方法對(duì)落葉松進(jìn)行鑒定主要采取RAPD等方法，其中大多為種間的鑒定。主要研究有:管玉霞利用落葉松的部分葉綠體基因、線粒體基因和核糖體ITS序列，獲得了rbcL基因上的一個(gè)SNP標(biāo)記，并結(jié)合線粒體特異片斷f－13、B－11可以對(duì)西部、美洲、日本和興安、長(zhǎng)白落葉松做出準(zhǔn)確快速的鑒別［14］;曲麗娜等［15］用RAPD和ISSR分子標(biāo)記對(duì)興安落葉松、長(zhǎng)白落葉松及日本落葉松進(jìn)行了不同物種間的鑒定。對(duì)于其它針葉樹種，雖然有人對(duì)無(wú)性系和雜交種進(jìn)行過(guò)鑒別，但所用引物數(shù)量和所分析的無(wú)性系數(shù)量都較少［16］。張磊等［11］對(duì)長(zhǎng)白落葉松、興安落葉松和日本落葉松的種間、無(wú)性系進(jìn)行了有效鑒別。而對(duì)于主要靠雜交育種及種子園等有性繁殖的落葉松來(lái)說(shuō)，優(yōu)良家系及雜種的鑒別十分重要。本研究的試驗(yàn)材料是從針葉中提取DNA，方法簡(jiǎn)單、容易操作，且適用于落葉松雜種的早期選擇。在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)記錄數(shù)據(jù)結(jié)果的引物重復(fù)試驗(yàn)了12次，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并在試驗(yàn)后期對(duì)材料隨機(jī)編號(hào)，然后用特異性引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，得到的結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相符合。

本研究找到的合適的引物能夠?qū)β淙~松家系進(jìn)行鑒別，可以為落葉松雜種優(yōu)勢(shì)早期預(yù)測(cè)、雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理研究提供技術(shù)支持。所有家系在0.4的遺傳距離上可以分成4種雜交組合，說(shuō)明不同雜交組合的落葉松可以通過(guò)遺傳距離來(lái)進(jìn)行區(qū)分。本研究表明，分子標(biāo)記的結(jié)果可以真實(shí)、穩(wěn)定地反映出家系間由于遺傳關(guān)系造成的差別。

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