黃建國 ，吳立文 ，駱志輝 ，黃碧梅 ，劉菊花 ，劉彩珍

(1、廣東省龍川縣婦幼保健院檢驗(yàn)科；2、兒科；3、廣東省龍川縣人民醫(yī)院兒科，廣東 龍川 517300)

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發(fā)病為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征。引起手足口病的病原體主要為腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)，其中EV71不僅引起HFMD，而且可引起腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1]。從1996年來，在東南亞、中國臺灣、香港等地不斷有HFMD暴發(fā)流行[2-3]。2008年在我國安徽和河南部分縣市發(fā)生EV71感染引起的HFMD流行，并造成患兒死亡。近年，地處廣東東北部山區(qū)的龍川縣也出現(xiàn)HFMD散發(fā)病例，以每年4～6月間為發(fā)病高峰。我們收集了部分在我院和龍川縣人民醫(yī)院住院和門診就診的臨床疑似手足口病的患兒標(biāo)本，應(yīng)用分子生物學(xué)方法對這些標(biāo)本進(jìn)行了腸道病毒基因檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床病例 所有病例均來自我院和龍川縣人民醫(yī)院2009至2010年住院和門診病人，按照衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2008年版)》標(biāo)準(zhǔn)[4]，共收集臨床診斷手足口病病例56例，其中男32例，女25例，年齡5月～12歲。

1.2 標(biāo)本的采集 用無菌方法采集急性期病人的糞便1～2g，置于滅菌的帶蓋玻璃瓶中，同時(shí)用干棉簽準(zhǔn)確地擦拭患兒的鼻咽部后，立即浸泡于含2～3ml Hank＇s液的滅菌試管,以上標(biāo)本均立即-70℃凍存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、隨機(jī)引物、RNAsin酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品，病毒核酸提取試劑為美國GIBCOL公司的TRIZOL-LSReagent RNA提取試劑盒。

1.4 引物序列[5]引物由南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院兒科張壽斌主任提供。所用的引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測EV所用的引物及序列

1.5 EV核酸提取 采用TRIZOL-LSReagent提取總 EV RNA。 取 0．5～1g 糞便溶解于 0.5～2ml生理鹽水中，充分振蕩混勻，5000r/min離心5min，取150μl上清液 (或咽拭子液)，加 TRIZOL-LS Reagent 450μl， 混勻， 加 120μl氯仿，2～8℃12000g 離心15min， 取上清液加 300μl異丙醇，2～8℃12 000g離心 10min， 沉淀物用 75%乙醇 200μl洗脫，2～8℃7500g離心5min后去離子水溶解，凍存于-70℃。

1.6 EV通用引物的RT-PCR檢測 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反 應(yīng) ： 取 5 ×AMV buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl， 隨 機(jī) 六 聚 體 引 物 l.0μl，EV 模 板10μl，cDNA 反應(yīng)液總體積為 15μl，反應(yīng)參數(shù)：42℃，45min。采用套式PCR檢測EV RNA，第一輪PCR反 應(yīng) 條 件 ：cDNA 模 板 5μl，10×PCR buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl，50μmol/L EVP160/EVP580各 0.15μl，Taq 酶 1U， 反應(yīng)液總體積共 30μl，在PE6000型DNA擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性 180s，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 40s，擴(kuò)增 30 個循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)條件：取第一次PCR產(chǎn)物3μl作模板，用 50μmol/L EVP250/EVP 500引物各0.15μl進(jìn)行第二次擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同第一輪。取第二輪PCR產(chǎn)物10μl用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色(含 EB 0.5μg/ml)，100V 電泳 30min，紫外燈下觀察，約于312bp位置見清晰條帶為陽性。每次均設(shè)腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)IYW作陽性對照和PBS液陰性對照，標(biāo)本處理RNA提取、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳PCR產(chǎn)物檢測均在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.7 RT-PCR特異檢測EV71和CoxA16采用RT-nPCR檢測EV71和CoxA16引物見表1，第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件基本同上述通用引物檢測EV，只是檢測EV71第二輪PCR退火溫度為58℃，檢測CoxA16第二輪PCR退火溫度為56℃，片段大小分別為193bp和275bp。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 配對計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，差別有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 手足口病腸道病毒RT-nPCR檢測結(jié)果

用通用引物RT-nPCR檢測共56例病人的標(biāo)本，結(jié)果37例病人呈現(xiàn)總腸道病毒陽性，陽性率66.1%。再用RT-nPCR方法進(jìn)行分型檢測，檢出EV71陽性 15份，占標(biāo)本總數(shù)的26.8%；CoxA16陽性13份，占標(biāo)本總數(shù)的23.2%；EV71和 CA16均陰性9例，占標(biāo)本總數(shù)的 16.1%。RT-nPCR分型檢測結(jié)果見圖1。

圖1 RT-nPCR分型檢測電泳結(jié)果

2.2 不同性別嬰幼兒童 EV71和CoxA16檢出情況

對56份臨床診斷手足口病病例中，其中男32例，女25例，男女陽性率分別為62.5%(20/32)和68%(17/25)；EV71男女陽性率分別為31.3%(10/32)和20%(5/25)；CoxA16男女陽性率分別為18.8%(6/32)和 28%(7/25)。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(χ2=0.6575，P＞0.05)，不同性別間EV71及CoxA16的發(fā)病率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表 2)。

表2 手足口病病原體檢測結(jié)果的性別分布(%)

2.3 不同年齡兒童EV71和CoxA16檢出情況

將病例分為 6個年齡組，5歲以下兒童是 EV感染的高危人群，占85.7%(48/56)。EV71感染者中最小年齡11個月，最大8歲(見表3)。

表3 不同年齡段手足口病病原體檢測結(jié)果(%)

3 討論

人類腸道病毒(EV)屬于小RNA病毒科，有近70個血清型，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒A組和B組，埃可病毒以及新型腸道病毒EV68-72型。EV感染較為常見，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，手足口病(HFMD)是其常見的臨床表現(xiàn)之一。EV71是1972年美國學(xué)者從一腦炎病人中分離出一種新型腸道病毒，是上世紀(jì)九十年代末在東南亞部分地區(qū)爆發(fā)流行的主要病原體[3]。EV71感染以手足口病為主，部分出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，導(dǎo)致肺水腫和肺出血而死亡。2008年在我國的山東臨沂和安徽阜陽河南等地區(qū)出現(xiàn)手足口病疫情，也主要由EV71型為主。我省的深圳和廣州近年均有手足口病散發(fā)流行[6-7]，我縣地處廣東東北部山區(qū)，近年也出現(xiàn)HFMD散發(fā)病例，以每年4～6月間為發(fā)病高峰，為了了解在本地區(qū)出現(xiàn)的手足口病的血清型，我們收集了56例在我院住院和門診就診的手足口病病例，先采用腸道病毒5’端保守的非編碼區(qū)通用引物RT-nPCR檢測，并根據(jù)EV71和CoxA16病毒特異性引物,對通用引物陽性的病例進(jìn)行EV71和CoxA16病毒的快速RT-nPCR分型檢測，結(jié)果顯示，56例臨床診斷手足口病病例，37例腸道病毒通用引物 RT-nPCR檢測呈陽性，陽性率為66.1%，敏感性略低于實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢出率[8]。分型檢測顯示，在我縣流行的手足口病病原體也主要是腸道病毒EV71和CoxA16血清型，占75.7%(28/37)，與在我省的深圳和廣州流行情況相似，發(fā)病以嬰幼兒為主 (年齡<5歲以下兒童)，不同性別之間無明顯差別。

EV的臨床檢測方法主要有血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。血清學(xué)方法包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)或ELISA法，但由于EV血清型繁多，并且許多血清型抗體間有交叉反應(yīng)，特異性較差，加之抗體滴度感染2周后才能達(dá)到檢出水平，EV特異性血清學(xué)檢測方法目前還不成熟，臨床應(yīng)用存在諸多限制。近年發(fā)展的檢測EV感染的分子生物學(xué)方法主要有RT-nPCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具有較高的敏感性和特異性[5，9]。我們采用的是套式RT-nPCR技術(shù)，進(jìn)行兩次特異性引物PCR擴(kuò)增，提高了檢測結(jié)果的特異性，也避免一次PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的假陰性，增加了檢測的敏感性，RT－nPCR檢測當(dāng)天即可完成，是一種快速、敏感和特異的方法，適合應(yīng)用于對EV感染的檢測和早期診斷。我們檢測的56例病人中，檢測的標(biāo)本包括糞便和呼吸道分泌物，采用RT-nPCR均檢測出EV，有報(bào)道該方法適用于呼吸道分泌物、糞便、腦脊液和組織中EV RNA的檢測，是診斷EV感染的有效方法[6]。

手足口病雖然是一種自限性疾病，但EV71型感染部分侵犯腦組織，可造成患兒死亡，對EV71至今尚無疫苗預(yù)防，一旦發(fā)病沒有特異性藥物治療，因此對EV71等EV采取有效的預(yù)防控制措施至關(guān)重要。包括加強(qiáng)對公共場所及托幼機(jī)構(gòu)衛(wèi)生的監(jiān)測力度，實(shí)行早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早報(bào)告、早隔離治療、早處理疫點(diǎn)等措施。

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