匡仁銳，朱遵偉 ，鄧 君 ，李 賀，崔蘇萍

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科；2、江西省人民醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌 30006)

尿道下裂是一種因前尿道發(fā)育不全而致尿道開口達(dá)不到正常位置的陰莖畸形,是男童泌尿生殖系統(tǒng)最常見的先天性畸形之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。CTGF是近年來備受重視的促纖維化蛋白因子，可通過基質(zhì)金屬蛋白酶參與基質(zhì)的重塑，在機(jī)體的各類創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，病理狀態(tài)下CTGF可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和成纖維細(xì)胞增生，參與器官纖維化進(jìn)程[1]。本研究希望明確CTGF與陰莖體型及會陰型尿道下裂的關(guān)系，從而推測CTGF可能在尿道下裂的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年4月至2010年12月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院和門診治療的尿道下裂及包皮手術(shù)患者32例。尿道下裂組16例，平均年齡6.3(3～17)歲。根據(jù)陰莖伸直后尿道外口位置分為輕型(陰莖頭型、冠狀溝型、陰莖遠(yuǎn)側(cè)型)、中型(后2/3陰莖體型)、重型(陰莖陰囊型、陰囊型、會陰型)。其中中型11例，重型5例，均為散發(fā)性患者，均無泌尿生殖系統(tǒng)的其它異常。對照組16例，均為接受包皮環(huán)切術(shù)的患者，平均年齡16(3～18)歲，無其它合并癥存在。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2 .1標(biāo)本處理 組織樣品為術(shù)中留取的中度(陰莖體型)和重度(會陰型)尿道下裂患者包皮組織和同齡正常患者包皮環(huán)切術(shù)的包皮組織(每組各16例)，分別做好標(biāo)記后裝入凍存管，立即置于液氮罐中保存。1.2.2總RNA抽提 收集組織標(biāo)本，按Trizol試劑說明書提取總RNA。所提總RNA行紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280在1.8～2.0之間，并計(jì)算濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 .3 半定量 RT–PCR Trizol法提取總 RNA，以RT–PCR法對包皮組織CTGF的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。一步法RT-PCR試劑盒購自美國Fermantas公司，CTGF以及GAPDH引物由上海生工生物工程公 司 合 成 ，CTGF 上 游 引 物 ：5＇-GAAGGGCAAAA AGTGCATCC-3＇， 下 游 引 物 ：5＇-GACAGTTGTAATGGCAG-GCA-3＇， 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 235bp。RT-PCR過程簡述如下：取約1μg總RNA加入反應(yīng)體系為：5×buffer 4μl，10mmol/L dNTPs 2μl， 上下游引物各 0.5μl，M-Mulv 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl，RNase 抑制物1μl，加無核酸酶水至體積 20μl，充分混勻。 按 48℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 45min，94℃變性 2min，94℃變性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 2min共 30個循環(huán)，再72℃延伸5min，所得產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行CTGF和GAPDH條帶灰度分析，計(jì)算CTGF/GAPDH值。

1.2 .4 Western blot檢測CTGF在蛋白水平上的表達(dá)變化：取出各組的包皮組織，重量約為40mg，用勻漿器在冰浴中研磨成漿，加入RIPA裂解液300ml，冰浴 20min，4℃下離心，12000g離心 30min， 分裝蛋白，-80℃保存，另留取少量采用Bradford法蛋白定量。各樣本均取50μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，用CTGF特異性一抗 (1:500稀釋的兔抗人CTGF多克隆抗體，美國Abcam公司)孵育，4℃過夜。二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG1:4000)室溫孵育1h后加入ECL顯色底物，暗室曝光，顯影，定影X膠片掃描，最后通過Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析，并按得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖。

1.2 .5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以 P＜0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測CTGF mRNA的表達(dá)變化CTGFmRNA表達(dá)水平在散發(fā)的單純性尿道下裂患者中明顯高于對照組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。兩組組織中RT-PCR的電泳條帶灰度CTGF/GAPDH 的比值分別為 0.28±0.05，0.85±0.04，如圖1，2所示。

圖1 兩組組織中CTGFRT-PCR檢測結(jié)果

圖2 CTGF基因在兩組組織中的表達(dá)變化

2.2 Western blot檢測CTGF蛋白的表達(dá)變化 CTGF蛋白條帶在尿道下裂組較對照組蛋白條帶深，提示尿道下裂組中CTGF蛋白水平表達(dá)升高。兩組中CTGF/β-actin 灰 度 比 值 分 別 為 0.45±0.04、1.24±0.08，兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)見圖 3、4。

圖3 兩組組織中CTGF蛋白Western blot檢測結(jié)果

圖4 CTGF蛋白在兩組組織中的表達(dá)變化

3 討論

尿道下裂的病因比較復(fù)雜，涉及遺傳、激素和環(huán)境等因素，在尿道下裂發(fā)生的危險(xiǎn)因素中妊娠早期母體(被動)吸煙、接觸農(nóng)藥殺蟲劑、胎兒低出生體質(zhì)量可能增加胎兒尿道下裂的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在孕期給母鼠一定的雌激素干預(yù)，可以誘導(dǎo)雄性胎鼠發(fā)生先天性尿道下裂[3]，為雌激素或抗雄激素物質(zhì)是導(dǎo)致尿道下裂的一個重要環(huán)境因素的假說提供了理論支持。CTGF為雌激素反應(yīng)基因，是TGF-β信號通路中重要組成部分，在孕期其轉(zhuǎn)錄可被雌激素調(diào)節(jié)[4，5]，而TGF-β信號可參與生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育[6]。在病理狀況下CTGF過度表達(dá)時可以直接作用于間充質(zhì)來源細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)，促進(jìn)其增殖，還能作為TGF-β的下游蛋白介導(dǎo)其促纖維化作用，而且TGF-β已被證實(shí)是炎性組織形成及不同組織中纖維化發(fā)生的關(guān)鍵介導(dǎo)因子[7]。李世榮等[8]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人增生性炎性組織成纖維細(xì)胞與正常皮膚細(xì)胞相比，膠原合成、CTGF基因及CTGF蛋白表達(dá)均顯著增高。CTGF受到多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)，如血管緊張素Ⅱ、HGF、TGF-β1等。在成纖維細(xì)胞中，CTGF啟動子含有TGF-β應(yīng)答元件，可被TGF-β1選擇性誘導(dǎo)激活[9]。Twigg SM等[10]研究發(fā)現(xiàn)在人成纖維細(xì)胞中，重組CTGF可誘導(dǎo)纖維連接蛋白mRNA的表達(dá)和蛋白的合成，作用效果呈劑量依賴性，CTGF中和性抗體可以顯著降低但不能完全抑制這種作用。Fan WH等[11]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果CTGF過度表達(dá)，血管平滑肌細(xì)胞的遷移率和生長率都將有顯著增加，CTGF中和性抗體可逆轉(zhuǎn)此作用。

本研究結(jié)果顯示，陰莖體型及會陰型尿道下裂患者包皮組織中CTGFmRNA和CTGF蛋白的表達(dá)均較正常人顯著升高。我們推測CTGF所涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和尿道下裂的發(fā)生有關(guān)，CTGF可能是尿道下裂中的一個關(guān)鍵調(diào)控基因。最近周娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)尿道下裂和CTGF基因相關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)雌激素可能通過上調(diào)CTGF的表達(dá)參與調(diào)節(jié)生殖結(jié)節(jié)的異常發(fā)育，導(dǎo)致尿道下裂。

在尿道形成過程中，CTGF是否干擾了泌尿生殖細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)化有待于深入研究。目前，有關(guān)散發(fā)的單純性尿道下裂的研究不多，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了結(jié)締組織生長因子(CTGF)和散發(fā)的單純性尿道下裂相關(guān)，CTGF有可能通過調(diào)控尿道下裂相關(guān)基因的表達(dá)水平，或通過CTGF相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干擾尿道的正常發(fā)育而導(dǎo)致尿道下裂。進(jìn)一步研究尿道下裂中產(chǎn)生CTGF的分子基礎(chǔ)或它作用的靶基因，探索CTGF相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，有可能揭示散發(fā)的單純性尿道下裂的發(fā)病機(jī)制。選擇治療策略阻斷CTGF的基因表達(dá)，應(yīng)用CTGF中和抗體或受體拮抗劑來阻斷 CTGF信號傳導(dǎo)表達(dá)和生物學(xué)活性，這可能是控制纖維化疾病發(fā)生和發(fā)展的一種新手段，為今后防治炎性疤痕纖維化疾病帶來新的希望。

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