劉美鳳蔣利榮劉華鼐林靜群

(1.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640;2.廣東省綠色化學(xué)產(chǎn)品技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510640)

II型糖尿病占糖尿病發(fā)病群體的90%，其發(fā)生的主要機制為胰島素抵抗，在分子水平上表現(xiàn)為胰島素與受體結(jié)合后信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙.蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)在胰島素上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中起負向調(diào)節(jié)作用［1］，可使蛋白酪氨酸去磷酸化，從而阻斷胰島素與受體結(jié)合過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］，導(dǎo)致胰島素抵抗，致使血糖升高.過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是脂肪合成、能量穩(wěn)定、糖脂代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)控因子，激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)可增強胰島素與其受體結(jié)合的信號傳導(dǎo)，提高胰島素的敏感性，從而有效降低血糖.此外，PPARγ還可減弱腫瘤壞死因子α和瘦素誘導(dǎo)的胰島素抵抗［3］.PTP1B和PPARγ已成為治療II型糖尿病新穎的靶標(biāo).另外，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑可減少葡萄糖的產(chǎn)生和攝取，降低餐后血糖.因此，篩選和尋找安全有效的α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制劑是藥學(xué)家的關(guān)注熱點.

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴Psidium guajavaL.的干燥葉及帶葉嫩莖，其提取物具有抗氧化、清除自由基、保護心臟［4］、降血糖和降血壓［5］等多種藥理活性.對其的化學(xué)研究主要圍繞著抗微生物和治療急性腹瀉及痙攣活性，分離得到黃酮和三萜類化合物［6-10］，但番石榴葉治療II型糖尿病的活性成分及其機理尚不清楚.Discovery Studio2.1軟件中的CDOCKER模塊是基于CHARMm的半柔性對接程序，采用Softcore Potentials以及Optional grid representation將配體分子與受體活性位點進行對接.文中在化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，借助Discovery Studio 2.1軟件的CDOCKER模塊，以番石榴葉中分離得到的和已知的三萜皂苷類、黃酮類和鞣質(zhì)類化合物為配體，分別與PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶進行分子對接，根據(jù)其對接位點數(shù)和對接親和能的大小進行打分，分析番石榴葉治療II型糖尿病的活性成分，為進一步的理性設(shè)計提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 酶/受體結(jié)構(gòu)信息來源及處理

從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載所用到的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)模型.使用Discovery Studio軟件中的Protein Reports and Utilities Tools除去單晶衍射圖中的水分子、金屬離子、乙酸分子，只保留這4個蛋白分子與原始配體，優(yōu)化氫鍵值設(shè)為Sample Water Orientations，最后得到可用于對接的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的三維立體結(jié)構(gòu).

1.2 配體小分子化合物庫的準(zhǔn)備

番石榴葉中分離得到和已知的共32個化合物為配體小分子化合物庫，主要含有三萜皂苷、黃酮以及鞣質(zhì)類化合物［11］，見表1.首先利用Discovery Studio軟件的繪圖功能，繪制出化合物的立體結(jié)構(gòu)，接著對其進行加氫、加電荷，最后對小分子的構(gòu)象進行能量優(yōu)化處理.

表1 番石榴葉中的化合物Table 1 Compounds in Psidium guajava leaf

續(xù)表1

1.3 配體與酶/受體的分子對接

利用Discovery Studio 2.1軟件的CDOCKER模塊進行分子對接，當(dāng)對接完成后，可以在Out put的文件夾里看到對接的結(jié)果.分子對接的結(jié)果以對接能作為對接分值的打分指標(biāo)，對接能的負絕對值越大，證明受體與底物的對接親和力越大，同時也預(yù)測小分子與受體結(jié)合的活性越高.

2 結(jié)果與討論

2.1 與PTP1B的作用

表2 番石榴葉中小分子化合物與PTP1B的對接結(jié)果Table 2 Docking results of PTP1B with small molecules compounds in Psidium guajava leaf

與PTP1B進行分子對接的結(jié)果見表2.三萜皂苷類化合物沒有對接位點，而黃酮類化合物中，山奈酚的親和活性最強，其分子對接效果見圖1(a).可見2-苯基色原酮為母核的黃酮類化合物，若C-2位連接的苯環(huán)與母核不在同一平面時，將大大降低PTP1B和化合物的親和能力，空間結(jié)構(gòu)或許是其中主要的影響因素;而連接上糖苷的黃酮類化合物無對接位點.PTP1B與咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸和阿魏酸的對接能量低，對接活性較高，可能與其結(jié)構(gòu)簡單、空間位阻小，且其酚羥基的間位都接有羧基或者丙烯酸結(jié)構(gòu)有關(guān).PTP1B與咖啡酸的對接效果見圖1(b).

圖1 PTP1B與山奈酚分子和咖啡酸分子的對接效果Fig.1 Molecule modeling of PTP1B docked with kaempferol and caffic acid

2.2 與PPARγ的作用

表3 番石榴葉中小分子化合物與PPARγ對接結(jié)果Table 3 Docking results of PPARγreceptor with small molecules compounds in Psidium Guajava leaf

圖2 PPARγ與α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、沒食子酸的分子對接效果Fig.2 Moleculemodeling of PPARγdocked withα-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside，querecetin and gallic acid

與PPARγ進行分子對接時，3類化合物均有對接位點(見表3)，對接效果最好的為α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素和沒食子酸(見圖2).其中，α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對接位點比β-谷甾醇多，但后者與受體的親和力卻要強得多，可能與β-谷甾醇的構(gòu)型以及其糖基化后空間結(jié)構(gòu)變化有關(guān).三環(huán)共平面的化合物與PPARγ的親和力更好.鞣質(zhì)類化合物的酸性以及其空間的平面結(jié)構(gòu)對其對接結(jié)果有直接的影響.

2.3 與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的作用

分別用α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶與配體庫內(nèi)化合物依次進行分子對接，自動搜索后對接位點數(shù)為0.這可能是由于α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的結(jié)合空腔過于狹窄，而Discovery Studio軟件比較適合球形空腔的分子對接，因此在自動搜索時出現(xiàn)沒有任何對接位點的情況.

2.4 討論

文中通過分子模擬和對接評分的方法，篩選出番石榴葉中能與PTP1B、PPARγ對接的化合物，其中黃酮和鞣質(zhì)類化合物與PTP1B和PPARγ的結(jié)合活性較高，尤其是山奈酚、沒食子酸、Guavin B、α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷這4個小分子化合物.

與PTP1B對接時，若底物含有苯環(huán)，則對接分值比較理想，但連接上糖苷后，會降低對接的可能性.若底物含有無取代苯環(huán)基團的小分子化合物，則其對接分值較差.含有直鏈烷烴型的小分子對接分值理想，但(CH2)n中n＞3，則對接分值不理想;當(dāng)受體為PPARγ，四環(huán)三萜類的對接分值比五環(huán)三萜類理想，而且在C-2位連接上糖苷鍵后有較大的提高.當(dāng)?shù)孜餅榉宇悤r，含有糖苷鍵的小分子化合物比直鏈烷烴型的對接分值理想，且其烷烴鏈越長，對接分值越理想.

番石榴葉中黃酮類以及鞣質(zhì)類化合物與蛋白質(zhì)受體的活性部位間的作用并沒有結(jié)合水分子的參與，二者通過疏水作用和氫鍵作用相互結(jié)合.因此，可以對活性較高的黃酮類、鞣質(zhì)類小分子進行立體結(jié)構(gòu)改造，引入有疏水作用的基團，提高其與PTP1B酶和PPARγ對接的親和活性，進一步提高其抗糖尿病活性.

3 結(jié)語

文中采用虛擬篩選的方法所得結(jié)果，一定程度上佐證了Oh等［12］給出的番石榴葉提取物通過抑制PTP1B活性而降低Leprdb/Leprdb小鼠血糖的結(jié)論.盡管虛擬篩選有可能存在假陽性結(jié)果，與動物實驗和體外實驗結(jié)果可能會有一定偏差，但分子模擬這種方法針對性強，是一種較好的藥物篩選手段，尤其可為后期基于藥物靶標(biāo)的活性成分研究和結(jié)構(gòu)修飾提供重要的指導(dǎo)和借鑒.

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