劉 梅 李小剛 譚 華

1)成都市第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 成都 610000 2)瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 瀘州 646000

腦缺血-再灌注損傷是多種致病因素共同作用互相促進(jìn)的結(jié)果。缺血性腦血管病在治療上強(qiáng)調(diào)早期綜合治療。β-七葉皂甙鈉已被應(yīng)用于腦水腫及腦神經(jīng)功能失調(diào),具有消水腫及清除自由基,改善微循環(huán),抑制細(xì)胞凋亡等作用[1],從而減輕缺血-再灌注損傷,達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。我們旨在研究β-七葉皂甙鈉在自由基方面對(duì)缺血再灌注損傷的影響,為臨床治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠45只,體質(zhì)量200～300 g;隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(n=15)、缺血-再灌注組(n=15)和β-七葉皂甙鈉治療組(n=15)。治療組再灌注即刻腹腔內(nèi)注射β-七葉皂甙鈉注射液(10 mg/kg),缺血-再灌注組將β-七葉皂甙鈉換成等毫升生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 栓線的處理:為保證能完全堵住MCA的起點(diǎn),并避免傷及血管內(nèi)皮和刺破血管,應(yīng)對(duì)線栓頭端進(jìn)行“鈍化”處理,將尼龍線放入0.1%多聚賴氨酸中浸泡10 h,然后取出,在60℃烘箱中干燥1 h備用,使線栓頭變得略鈍圓。整個(gè)過程并不改變尼龍線的直徑。

1.2.2 大鼠缺血-再灌注模型的制作:采用Zea Longa[2]的大腦中動(dòng)脈線栓法并加以改進(jìn),將動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈,在頸內(nèi)動(dòng)脈下方穿一提拉線以暫時(shí)阻斷血流,在頸總動(dòng)脈距分叉處將尼龍線插入頸總動(dòng)脈,進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈下方栓線并固定。缺血2 h后輕輕拔出栓線,形成再灌注。根據(jù)Bederson等[3]評(píng)定方法分為0～3級(jí)。0級(jí):向地面伸展兩前肢,未見行為異常;1級(jí):腦損傷對(duì)側(cè)前肢持續(xù)屈曲;2級(jí):腦損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲,腦損傷對(duì)側(cè)肩內(nèi)收但無扭轉(zhuǎn),側(cè)推抵抗力弱;3級(jí):腦損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲,腦損傷對(duì)側(cè)肩內(nèi)收且有扭轉(zhuǎn),側(cè)推抵抗力弱。神經(jīng)癥狀達(dá)1～3級(jí)之一者判斷為模型成功。入選動(dòng)物斷頭取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)t棄之不用。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分:采用Zea Longa[2]的評(píng)分方法。大鼠局灶性腦缺血-再灌注后經(jīng)功能缺損評(píng)分:0分,無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失,活動(dòng)正常;1分,不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分,爬行時(shí)出現(xiàn)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,爬行時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒;4分,不能自行行走,有意識(shí)障礙。得分越高表明神經(jīng)功能缺損程度越重,相反損害較輕。

1.3.2 腦組織光鏡觀察:每組隨機(jī)選取5只動(dòng)物,取缺血區(qū)及其周邊腦組織,固定于4%甲醛中,4℃冰箱保存,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡觀察病理形態(tài)改變。

1.3.3 術(shù)后腦組織TTC染色:將假手術(shù)組和缺血-再灌注組的大鼠迅速斷頭取腦,去除低位腦干和小腦,將腦組織置入4%TTC溶液中,在37℃條件下孵育30 min,每4～5 min翻動(dòng)一次。

1.3.4 腦缺血區(qū)SOD和MDA含量的測定:于相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)(缺血2 h后再灌注6 h、12 h、24 h)斷頭截取缺血側(cè)皮層腦組織,稱重后制成10%的腦組織勻漿,按照試劑盒采用放射免疫法測定SOD和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)采用±s表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損害評(píng)分 假手術(shù)組動(dòng)物無明顯神經(jīng)功能缺失,治療組和缺血-再灌注組動(dòng)物均有不同程度的神經(jīng)功能缺失,且治療組神經(jīng)功能缺失有所改善,呈減輕趨勢,P＜0.05。見表1。

2.2 腦缺血-再灌注模型TTC染色 TTC目前被認(rèn)為是腦組織缺血性損傷的標(biāo)記物[4]。T TC能與正常線粒體氧化酶系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)而降解成深紅色的脂溶性化合物。受損線粒體缺乏降解T TC的酶而呈現(xiàn)白色使得受損組織與正常組織極易區(qū)分開來。TTC染色已被用于標(biāo)記腦梗死面積[4]。由于正常腦組織的酶使TTC分解變紅色,所以TTC染色時(shí),正常腦組織呈紅色,梗死灶呈白色[4]。從圖1我們可以看到,假手術(shù)組腦組織呈紅色,缺血-再灌注組大鼠皮質(zhì)梗死區(qū)呈蒼白色,未缺血區(qū)呈紅色,與大腦中動(dòng)脈支配的腦區(qū)一致,間接說明模型造模成功(見圖1～2)。

表1 術(shù)后各組神經(jīng)功能損害評(píng)分 (±s)

表1 術(shù)后各組神經(jīng)功能損害評(píng)分 (±s)

組 別n各時(shí)間點(diǎn)術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h假手術(shù)組150*0*0*缺血-再灌注組152.8±0.842.8±0.452.6±0.55治療組151.8±0.84*1.6±0.55*1.2±0.45*

2.3 病理結(jié)構(gòu)改變(HE染色) 假手術(shù)組腦組織的結(jié)構(gòu)較完整,缺血-再灌注組腦組織可見缺血壞死區(qū),細(xì)胞水腫明顯,神經(jīng)元崩解為大量的無定形組織,呈嗜伊紅染色,也可見膠質(zhì)細(xì)胞增生;治療組也可見神經(jīng)元壞死,但殘留的神經(jīng)元較多,細(xì)胞水腫程度相對(duì)較輕。見圖3～5。

2.4 術(shù)后各組腦組織SOD含量的變化 見表2。缺血-再灌注組和治組SOD含量顯著低于假手術(shù)組相(P＜0.05),治療組SOD含量明顯高于缺血-再灌注組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 術(shù)后各組腦組織M DA含量的變化 見表3。缺血-再灌注組和治療組MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05);治療組MDA含量與缺血-再灌注組比較明顯降低(P＜0.05)。

表2 術(shù)后各組腦組織SOD含量的測定(±s,U/mL)

表2 術(shù)后各組腦組織SOD含量的測定(±s,U/mL)

組 別n各時(shí)間點(diǎn)(n=5)術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h假手術(shù)組15 29.21±1.24*#29.45±0.64*#30.08±0.63*#缺血-再灌注組15 15.82±0.5818.05±1.0020.62±0.80治療組15 18.75±0.75*20.88±0.48*23.21±0.72*

表3 術(shù)后各組腦組織MDA含量的測定(±s,nmol/mL)

表3 術(shù)后各組腦組織MDA含量的測定(±s,nmol/mL)

組 別n各時(shí)間點(diǎn)(n=5)術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h假手術(shù)組15 6.18±0.22*#6.18±0.23*#6.19±0.23*#缺血-再灌注組15 13.72±0.512.32±1.0110.30±0.88治療組15 11.71±0.74*9.77±0.82*8.02±0.44*

3 討論

目前臨床上對(duì)于缺血性腦梗死的治療,目的主要是保護(hù)缺血半暗帶,阻止其發(fā)展成不可逆的缺血性損傷,超早期溶栓治療為缺血腦組織的再灌注提供了可能性,但再灌注的同時(shí)引起的氧自由基大量釋放。自由基是一類具有高度化學(xué)反應(yīng)活性的毒性很強(qiáng)的代謝產(chǎn)物。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,其含量的變化間接地反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化,因此通過測定MDA含量可以估價(jià)腦組織中氧自由基含量和組織損傷程度[5]。SOD是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),SOD進(jìn)入腦細(xì)胞漿、細(xì)胞外間隙,通過歧化的方式發(fā)揮清除超氧陰離子自由基的作用[6]。SOD在組織中的含量常作為清除氧自由基能力的主要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,假術(shù)組中SOD和MDA含量在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)無明顯變化,缺血-再灌注組腦組織SOD和MDA含量與假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)比較,SOD含量明顯降低,MDA含量顯著升高。在缺血-再灌注組中,SOD在缺血-再灌注后6 h活性最低,隨著時(shí)間延長活性逐漸增強(qiáng);MDA在缺血-再灌注后6 h時(shí)含量最高,12 h時(shí)逐漸降低,在24 h時(shí)含量最低,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MDA降低和SOD升高呈負(fù)相關(guān),這說明氧自由基參與了腦缺血-再灌注損傷過程;隨著腦組織損傷程度的加重,氧自由基釋放大量增加,代謝產(chǎn)物逐漸增加,故MDA含量增加,但機(jī)體隨之啟動(dòng)清除自由基系統(tǒng),故SOD含量雖然在6 h時(shí)活性相對(duì)較低,12 h后開始逐漸增加,24 h時(shí)達(dá)高峰。不過,由于我們沒有對(duì)腦缺血-再灌注后30 min、1 h或48 h甚至更多的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察,故不能判斷SOD和MDA的動(dòng)態(tài)變化過程,如機(jī)體還沒完全調(diào)動(dòng)抗自由基系統(tǒng),SOD是否在6 h時(shí)活性最低、在什么時(shí)候出現(xiàn)高峰、有沒有2次高峰等情況。自由基可能通過以下機(jī)制加重缺血性腦損傷:(1)自由基的代謝產(chǎn)物可攻擊細(xì)胞的脂類、蛋白質(zhì)及核酸等成分,其中活性氧自由基對(duì)生物膜(膜上多價(jià)不飽和脂肪酸)的脂質(zhì)過氧化損傷最為廣泛和嚴(yán)重,可致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變,完整性破壞;線粒體膜損傷可致能量代謝紊亂,呼吸鏈?zhǔn)軗p,氧化磷酸化脫偶聯(lián);溶酶體膜受損可致溶酶體酶釋放。(2)自由基攻擊蛋白質(zhì)可致蛋白質(zhì)變性、降解、功能喪失。(3)自由基攻擊DNA分子,可引起DNA損傷,導(dǎo)致基因突變,使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖分化異常的癌細(xì)胞,參與誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,有實(shí)驗(yàn)證實(shí)消除氧自由基可以減少培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡[7]。(4)自由基還可攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞膜,加重血管源性腦水腫[8]。從本實(shí)驗(yàn)中我們可以看出,缺血-再灌注組SOD含量在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)較假手術(shù)組低,而M DA含量反而高于假手術(shù)組,表明自由基參與了缺血性腦損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,β-七葉皂甙鈉治療組在不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SOD含量增加,MDA含量下降,與缺血-再灌注組各時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;從病理形態(tài)改變上我們也可以看出,β-七葉皂甙鈉治療組的神經(jīng)細(xì)胞壞死程度減輕,主要表現(xiàn)為輕度的細(xì)胞水腫,損傷程度明顯輕于缺血-再灌注組。神經(jīng)功能損害評(píng)分也顯示,β-七葉皂甙鈉治療組明顯優(yōu)于缺血-再灌組。這說明β-七葉皂甙鈉能抑制氧自由基的產(chǎn)生,使MDA含量下降,同時(shí)使腦組織SOD活性升高。Guillaume等[9]研究發(fā)現(xiàn),歐馬栗提取物(horse chestnut extract,HCE,其中含70%的七葉皂甙)具有抗自由基作用,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HCE呈劑量依賴性抑制酶性和非酶性引發(fā)的脂質(zhì)過氧化;體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí),HCE能減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞及其周圍組織的毒性作用。張奕等[10]通過對(duì)家兔腦皮質(zhì)組織SOD活性和MDA濃度的測定,發(fā)現(xiàn)5 mg/kg的β-七葉皂甙鈉能夠提高腦組織SOD的活性、降低MDA含量。β-七葉皂甙鈉的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一可能是通過抗自由基途徑,以減輕自由基對(duì)腦細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)的損傷,減輕腦水腫、細(xì)胞凋亡。

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