王明臣,蔣薇薇,張善鋒,王好東,宋 宇,趙 勤,董子明

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室鄭州 450001△男,1963年3月生,博士,教授,研究方向:腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制及干預(yù)防治,E-mail:Wangm c@zzu.edu.cn

研究[1]表明,前列腺癌組織和前列腺癌細(xì)胞系存在DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)β的高表達(dá)。DNA polβ高表達(dá)介導(dǎo)過(guò)多的DNA低保真復(fù)制合成并由此導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性增加和細(xì)胞的自發(fā)突變率升高可能是介導(dǎo)腫瘤發(fā)生及腫瘤化療中一些抗癌藥物耐受產(chǎn)生的重要分子機(jī)制[2-4]。因此,尋求有效干預(yù) DNA polβ過(guò)表達(dá)并使其呈現(xiàn)適宜水平表達(dá)的線索和途徑,對(duì)于腫瘤的有效干預(yù)防治具有重要理論和實(shí)用意義。作者所在的課題組前期利用RNA干擾這一基因阻斷技術(shù),以pSUPERneoGFP載體中的H1為啟動(dòng)子, DNA polβ為靶基因,成功構(gòu)建了2個(gè)DNA polβ靶向siRNA表達(dá)載體(pSUPERneoGFP-PS1和pSUPERneoGFP-PS2)[5]。該研究將其轉(zhuǎn)染人前列腺癌PC3細(xì)胞,觀察對(duì)DNA polβ高表達(dá)的沉默效應(yīng)及不同程度抑制的DNA polβ功能狀態(tài)對(duì)PC3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,旨在揭示DNA polβ基因在細(xì)胞內(nèi)的適宜表達(dá)和功能狀態(tài),為前列腺癌的干預(yù)防治提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和重組載體 人前列腺癌PC3細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。靶向DNA polβmRNA的siRNA表達(dá)載體1(pSUPER-neoGFP-PS1)和表達(dá)載體2(pSUPERneoGFP-PS2)以及對(duì)照siRNA表達(dá)載體pSUPERneoGFP-SC,由作者所在課題組構(gòu)建保存[5]。

1.2 細(xì)胞分組 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按 Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,轉(zhuǎn)染后首先用 600 mg/L的 G418篩選,1～2 d后細(xì)胞大量死亡,僅余少量細(xì)胞,G418改為維持濃度 200mg/L,經(jīng)過(guò) 2～3周逐漸形成抗性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-PS1、pSUPERneoGFP-PS2、pSUPERneoGFP-CS和轉(zhuǎn)染空pSUPERneoGFP的細(xì)胞。各轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別成組,并設(shè)未轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞組,每組接種 6個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)24 h。

1.3 各組PC 3細(xì)胞DNA polβm RNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。DNA polβ上游引物5'-GAGAAG AACGTGAGCCAAGC-3'(189～208),下游引物5'-CATCCATGTCACCACTGGAC-3'(690～671),擴(kuò)增片段大小 206 bp。內(nèi)參 β-actin上游引物 5'-ACACTGTGCCCATCACGAGG-3'(555～575),下游引物5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'(929～947),擴(kuò)增片段大小520 bp。用Qiagen公司試劑盒提取細(xì)胞總RNA并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)體系30μL:cDNA 5μL,Mix(含人DNA polβ引物及內(nèi)參引物各0.5μL,10×Buffer 3μL,5mmol/L 4× dTNP 1μL)6μL,Taq酶(1×106U/L)0.5μL,去離子水18.5μL。94℃預(yù)變性5m in;94℃變性50 s, 55℃復(fù)性 50 s,72℃延伸 60 s,三溫循環(huán) 35次;72℃末端延伸5 min。使用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng),對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度掃描,測(cè)定積分吸光度值(IA)。DNA polβmRNA的相對(duì)表達(dá)量以其IA與內(nèi)參IA的比值表示。

1.4 各組PC3細(xì)胞DNA polβ蛋白的表達(dá) 采用Western b lot法。收集各組細(xì)胞,超聲破碎細(xì)胞, Bradford法測(cè)定蛋白含量,取50μg樣品,進(jìn)行120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳;電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉4℃封閉6 h;TTBS洗膜5 min×3次。加入山羊抗人(DNA polβ一抗工作濃度1∶200)室溫孵育1 h。TTBS洗膜5min×3次,室溫。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗(1∶500)平緩搖動(dòng)孵育1 h,室溫。TTBS洗膜5min×3次。加入BCIP/NBT顯色液,避光30 min后,蒸餾水終止。

1.5 各組PC3細(xì)胞周期的測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取匯合度達(dá) 80%～90%的細(xì)胞,常規(guī)消化,PBS洗2遍。20 g/L多聚甲醛1 m L固定5 min,離心,PBS再洗 1遍。加胰蛋白酶液 250 μL,輕混,室溫放置10 min。加中和液200μL,輕混,室溫放置 10 m in。加 PI染料200μL,輕混, 2～8℃避光放置 10 min。用 300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾樣品后上機(jī),采用Cell Quest軟件分析圖像。資料用Madfit LT for Mac 3.0軟件分析處理,計(jì)算G0和G1期、S期、G2和M期PC3細(xì)胞百分率。

1.6 各組PC3細(xì)胞自發(fā)突變率的測(cè)定 采用體外哺乳類(lèi)細(xì)胞次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine,HGPRT)基因突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)。將5×105個(gè)待測(cè)細(xì)胞(轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的 PC3細(xì)胞)接種于培養(yǎng)瓶中,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,胰蛋白酶消化,加入含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清培養(yǎng)液,混勻,放入離心管以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以 6×106個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100 mm的平皿中,培養(yǎng)基中含有0.5 g/L的6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-TG),37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng) 7 d,平行做 10個(gè)平皿。將上述首次消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞每平皿接種 200個(gè),培養(yǎng)基中不含 6-TG,平行做 10個(gè)平皿,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下同樣培養(yǎng) 7 d。培養(yǎng)結(jié)束后,用乙醇-冰醋酸(體積比3∶1)固定,Giemsa染色,計(jì)數(shù)每皿集落數(shù)。集落形成率 =實(shí)際存活的細(xì)胞集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。自發(fā)突變率 =突變集落數(shù) ×集落形成率/接種細(xì)胞數(shù) ×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0分析。各組PC3細(xì)胞DNA polβmRNA和蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期以及自發(fā)突變率的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組PC3細(xì)胞DNA po lβ的mRNA及蛋白表達(dá)的變化及細(xì)胞周期 見(jiàn)圖1和表 1。

2.2 各組PC3細(xì)胞自發(fā)突變率的變化 見(jiàn)表2。

圖1 各組PC 3細(xì)胞中DNA polβ蛋白的表達(dá)1:轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-PS1組;2:轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-PS2組;3:轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-CS組;4:轉(zhuǎn)染空pSUPERneoGFP組;5:未轉(zhuǎn)染組。

表1 各組PC 3細(xì)胞po lβm RNA的表達(dá)水平比較

表2 各組PC 3細(xì)胞自發(fā)突變率比較

3 討論

研究[6]顯示,前列腺癌組織及人前列腺癌 PC3細(xì)胞系存在DNA polβ的高表達(dá)。DNA polβ過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致復(fù)制的錯(cuò)配率增加并由此引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性升高,可能是除 polβ基因突變以外,介導(dǎo)腫瘤發(fā)生的另一重要分子機(jī)制。該結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照(pSUPERneoGFP-CS)、轉(zhuǎn)染空siRNA載體及未轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染polβ靶向siRNA載體的PC3細(xì)胞,DNA polβ無(wú)論mRNA水平抑或蛋白水平的表達(dá)均受到顯著抑制,且pSUPERneoGFP-PS1的沉默抑制作用強(qiáng)于pSUPERneoGFP-PS2,幾近完全抑制。表明短發(fā)卡狀polβ靶向siRNA能快速有效、特異性地封閉DNA polβ的表達(dá)。其機(jī)制在于polβ靶向siRNA載體導(dǎo)入前列腺癌PC3細(xì)胞后,在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生短發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu),并在dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶的作用下加工成為19 bp大小的siRNA,引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。表現(xiàn)為與未轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體和轉(zhuǎn)染對(duì)照pSUPER-neoGFP-CS的PC3細(xì)胞相比,呈現(xiàn)部分抑制的轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-PS2細(xì)胞的S期比例明顯降低,對(duì)應(yīng)的細(xì)胞自發(fā)突變率亦顯著降低。而 polβ表達(dá)幾乎完全抑制的轉(zhuǎn)染pSUPERneoGFP-PS1細(xì)胞的S期比例反而顯著增加,自發(fā)突變率亦顯著升高。提示DNA polβ的過(guò)表達(dá)或表達(dá)完全“敲除”均有利于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,即細(xì)胞正常的分裂增殖及細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的維持依賴(lài)適宜的低濃度的DNA polβ的存在。

總之,作者利用RNA干擾技術(shù)對(duì)polβ基因的功能狀態(tài)研究揭示,細(xì)胞內(nèi)維持polβ所呈現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)酶和聚合酶兩種酶活性的適宜比例可能是非常重要的。尋求一些能夠有效調(diào)控細(xì)胞該酶兩種活性時(shí)相和消長(zhǎng)關(guān)系的線索和手段可能是有效干預(yù)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的新途徑。

[1]王明臣,唐琳,趙國(guó)強(qiáng),等.前列腺癌及良性前列腺增生組織中DNA聚合酶β、PTEN及Ha-ras基因mRNA檢測(cè)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2005,40(4):613

[2]Canitrot Y,Cazaux C,Frechet M,et al.Overexp ression of DNA polymerasebeta in cell results in amutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs[J].Proc Natl Acad Sic USA,1998,95(21):12586

[3]Bergolio V,Pillaire MJ,Lacroix-Trikim M,et al.Deregulated DNA polymerase beta induces chromosome instability and tumorigenesis[J].Cancer Res,2002,62(12):3511

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[5]王明臣,唐琳,趙國(guó)強(qiáng),等.前列腺癌及良性增生組織中DNA聚合酶β基因突變檢測(cè)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,40(4):611

[6]王明臣,宋宇,張善鋒,等.前列腺癌特異突變 DNA聚合酶 β真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定[J].中國(guó)老年學(xué)雜志2009,29(14):1758