陳瑞廷,楊錦建,賈占奎,胡寶利

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科鄭州 450052

#通訊作者,男,1962年 2月生,博士,主任醫(yī)師,研究方向:泌尿外科疾病的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:yangjinjian66@ 126.com

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤。膀胱癌主要依靠膀胱鏡檢查并取活組織檢查確診,但膀胱鏡檢查為有創(chuàng)檢查,且與膀胱炎癥不易區(qū)別。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),近年來(lái)廣泛應(yīng)用于基因定位、染色體進(jìn)化和遺傳毒理學(xué)等基礎(chǔ)研究。作者以膀胱鏡活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),采用FISH技術(shù)檢測(cè)尿脫落細(xì)胞用以診斷膀胱癌,并與尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果相比較,評(píng)價(jià)其對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值,同時(shí)分析不同分期、不同分化程度膀胱癌的染色體畸變情況。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2009年 7月至 2010年10月因肉眼血尿癥狀在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科住院的患者 100例,排除泌尿系結(jié)石、尿道息肉及上尿路腫瘤病變,其中男 62例,女 38例,年齡 31～82 (57.9±15.6)歲。膀胱鏡活檢確診為膀胱移行細(xì)胞癌 75例,腺性膀胱炎病變 25例。75例膀胱癌患者中,術(shù)后病理分期:Tis期7例,Ta期24例,T1期20例,T2期 14例,T3期 8例,T4期 2例;高分化 48例,低分化 27例;65例行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù), 10例行膀胱全切術(shù)。

1.2 標(biāo)本采集 患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細(xì)胞FISH檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查。留取250 mL以上的新鮮晨尿,1 h內(nèi)送檢。每例尿樣分為 2份,分別行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和FISH檢測(cè)。容器為一次性使用,清潔、干燥,開口大,有明顯標(biāo)記,尿液要防止異物混入。

1.3 FISH檢測(cè) 應(yīng)用北京金菩嘉公司提供的染色體探針試劑盒,包括CSP3/CSP7和GLP P16/CSP17兩組探針。實(shí)驗(yàn)步驟:取200 mL以上晨尿離心去上清,依次加入膠原酶B、KCl低滲溶液及固定液處理后,制備細(xì)胞滴片 2張,烤片機(jī)老化。將玻片放入37℃HCl與胃蛋白酶混合液中孵育10 min。2× SSC溶液漂洗玻片 2次,甲醛固定,梯度乙醇脫水,自然干燥。室溫避光,取7μL雜交緩沖液、1μL去離子水和 2μL染色體著絲粒探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域,立即加蓋玻片,橡皮膠封邊,78℃雜交儀變性5min。玻片置于濕盒中42℃過夜雜交,洗滌、復(fù)染后于熒光顯微鏡下分析觀察,攝片保存。GLP P16和CSP7探針為紅色信號(hào),CSP17和CSP3探針為綠色信號(hào)。按金菩嘉公司提供的正常閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果判定。4個(gè)探針至少 2種探針信號(hào)異常判定為陽(yáng)性。

1.4 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查 取約50mL的新鮮尿液離心,取沉淀制成細(xì)胞涂片,常規(guī) HE染色后鏡下觀察。每例患者連續(xù)檢測(cè) 3 d,發(fā)現(xiàn) 1次癌細(xì)胞即判為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)算尿脫落細(xì)胞學(xué)和FISH檢查的靈敏度、特異度和約登指數(shù),評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值;采用配對(duì) χ2檢驗(yàn)對(duì)不同分化程度和不同分期的膀胱癌患者的兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較;采用 χ2檢驗(yàn)對(duì)不同分化程度和不同分期膀胱癌患者FISH各探針陽(yáng)性率進(jìn)行比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

FISH陽(yáng)性表現(xiàn)見圖 1。以 4種探針聯(lián)合的FISH檢測(cè)和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度、特異度和約登指數(shù)計(jì)算結(jié)果見表 1,不同分化程度和不同分期膀胱癌患者 2種檢查結(jié)果的比較見表 2,不同分化程度、不同分期膀胱癌患者FISH各探針檢測(cè)結(jié)果的比較見表 3。

圖1 腫瘤細(xì)胞的FISH陽(yáng)性表現(xiàn)

表1 2種檢測(cè)方法的靈敏度、特異度和約登指數(shù)比較

表2 2種檢查結(jié)果的比較 例(%)

表3 FISH檢測(cè)結(jié)果分析 陽(yáng)性例數(shù)(%)

3 討論

FISH是在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù),近年來(lái)泌尿外科工作者將其應(yīng)用于膀胱癌的診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。Marin-Aguilera等[1]的研究結(jié)果顯示FISH用于診斷淺表性膀胱癌的靈敏度高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查;而兩者的診斷特異度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]也報(bào)道 FISH檢測(cè)比尿脫落細(xì)胞學(xué)具有更高的靈敏度,但兩者的特異度相似。Constantinou等[4]研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌 T1期患者FISH檢測(cè)陽(yáng)性率為80%,T2、T3期患者的陽(yáng)性率為 100%。該研究結(jié)果顯示:FISH檢測(cè)診斷膀胱癌的總靈敏度為0.827,明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的 0.387;而兩者特異度相似;此外,FISH檢測(cè)的約登指數(shù)較高,提示其真實(shí)性強(qiáng),對(duì)于高分化或Tis、Ta及T1期膀胱癌,FISH的陽(yáng)性率亦顯著高于尿脫落細(xì)胞學(xué),提示FISH檢測(cè)在診斷低級(jí)別及低分期膀胱癌時(shí)比尿脫落細(xì)胞學(xué)具有優(yōu)勢(shì)。

CSP3、CSP7、GLP P16及CSP17探針分別用于脫落細(xì)胞的3、7、9p21(p16)和17號(hào)染色體數(shù)目畸變的檢測(cè)。Veeramachaneni等[5]進(jìn)行的FISH研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌 3號(hào)染色體多倍體高達(dá) 76%。在對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌病理切片的FISH研究中,Krǜger等[6]發(fā)現(xiàn) 3號(hào)染色體多倍體占 27%,7號(hào)染色體多倍體占13.0%～76.2%,17號(hào)染色體多倍體僅占12%,9p21的純合性缺失率為28.6%～83.0%。多項(xiàng)研究[7-9]表明 3號(hào)染色體中的基因過表達(dá)與膀胱癌的病理分級(jí)相關(guān),7號(hào)染色體多倍體與病理分期、分化程度相關(guān),17號(hào)染色體的異?？赡艽龠M(jìn)了膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展。另有研究[10-11]認(rèn)為 9p21缺失是膀胱癌早期最常見的改變之一,其可能作為膀胱癌早期診斷和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的重要分子標(biāo)志。但多數(shù)研究[11-13]認(rèn)為 9號(hào)染色體的畸變與分期、分化程度無(wú)關(guān),但在低分化、低分期癌中常見。該研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌中CSP3、CSP7、GLP P16和CSP17探針的陽(yáng)性率分別為57.3%、57.3%、70.7%和54.7%;3號(hào)和7號(hào)染色體異常與膀胱癌病理分期有關(guān),隨著病理分期的升高,CSP3、CSP7探針陽(yáng)性率增加,但與分化程度無(wú)關(guān);而 9號(hào)和 17號(hào)染色體異常與病理分化程度有關(guān),隨著腫瘤細(xì)胞惡性程度的增高,GLP P16、CSP17陽(yáng)性率增加,但與病理分期無(wú)關(guān)。該研究亦發(fā)現(xiàn)在Tis期膀胱癌中P16異常達(dá)5/7,提示9p21異?？赡茉诎螂装┑脑缙谠\斷中起重要作用。

總之,FISH技術(shù)作為診斷和監(jiān)測(cè)膀胱癌的一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)性診斷方法,具有較高的靈敏度和特異度,其對(duì)提高人群膀胱癌的早期診斷率具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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