李 梅 彭輝燦

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病晚期的嚴重并發(fā)癥之一。視網膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)的形成是其主要致盲因素，預防RNV的形成至關重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在新生血管生成中是必不可少的重要誘導因子［1］。丙丁酚(普羅布考，Probucol)在20世紀70年代作為一種降脂藥物應用于臨床［2］，具有抗氧化、抗炎、抑制內膜增生和血管重構及改善內皮細胞功能的作用。本研究觀察丙丁酚對于體外培養(yǎng)的高糖環(huán)境下人視網膜微血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCEC)增殖抑制及VEGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 丙丁酚(美國Sigma公司);胰蛋白酶(美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)液(武漢博士德公司);噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO;AMRESCO公司);兔抗人Ⅷ因子IgG、兔抗人VEGF-IgG、免疫細胞化學試劑盒、DAB試劑盒(武漢博士德公司);培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科器械。

1.2 實驗方法

1.2.1 HRCEC培養(yǎng) 取材于手術室角膜移植術后新鮮人眼球，參考文獻［3-4］的培養(yǎng)方法進行HRCEC原代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于37℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內，每2 d換液1/3～1/2，待細胞長滿瓶底約80%，按1∶2傳代。

1.2.2 HRCEC鑒定 相差顯微鏡觀察細胞的生物學形態(tài)特征，將蓋玻片放入6孔板內，細胞爬片后，運用免疫細胞化學方法檢測第Ⅷ因子相關抗原抗體，顯微鏡下觀察其表達。

1.2.3 實驗分組 實驗分為以下7組:0組:不加細胞只加培養(yǎng)基的調零組;GL組:低糖對照組;G0組:高糖對照組;G1組:高糖+5 μmol·L－1丙丁酚組; G2組:高糖+10 μmol·L－1丙丁酚組;G3組:高糖+ 20 μmol·L－1丙丁酚組;G4組:高糖+40 μmol·L－1丙丁酚組;G5高糖+80 μmol·L－1丙丁酚組。丙丁酚作用時間均為24 h。高糖的葡萄糖濃度為25 mmol·L－1，低糖的葡萄糖濃度為5.5 mmol·L－1。

1.2.4 MTT檢測HRCEC的增殖 取生長良好的第3－4代HRCEC用于實驗。棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，2.5 g·L－1胰酶消化，加含體積分數(shù)20%胎牛血清高糖或低糖DMEM培養(yǎng)液，分別制成高糖和低糖細胞懸液，調整細胞濃度為60×106L－1，加入96孔板中，高糖共6組，低糖1組，以及調零組1組，每組6個復孔，每孔180 μL。將96孔板置于37℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內，24 h待細胞貼壁后G1～G5組分別加20 μL不同濃度丙丁酚，使丙丁酚終濃度分別為5 μmol·L－1、10 μmol·L－1、20 μmol·L－1、40 μmol· L－1、80 μmol·L－1。培養(yǎng)20 h后，每孔加5 g·L－1MTT液20 μL，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，用濾紙吸干水分，每孔加150 μL DMSO原液，振蕩10 min，待藍紫色結晶完全溶解后，用自動酶標儀570 nm波長測吸光度A值。上述條件下重復實驗3次。計算細胞增殖抑制率=［1－(實驗組A值－空白組A值)/ (對照組A值－空白組A值)］×100%。

1.2.5 免疫細胞化學方法檢測VEGF的表達 將消毒滅菌并標記好的醫(yī)用蓋玻片放入無菌的6孔板中，制作密度為60×106L－1的HRCEC懸液，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后分為5組。分別為低糖對照組GL:含體積分數(shù)10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng);高糖對照組G0:含體積分數(shù)10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng);高糖加藥組G1、G4、G5:含體積分數(shù)10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)+終濃度分別為5 μmol·L－1、40 μmol·L－1、80 μmol·L－1丙丁酚組，每組2個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出蓋玻片，PBS液洗滌，40 g·L－1多聚甲醛室溫固定20 min，體積分數(shù)3%H2O2-甲醇封閉內源性過氧化物酶，PBS液洗滌后加入兔抗人VEGF-IgG一抗(1∶100)，另一復孔加入PBS液，4℃過夜，PBS液洗滌，SABC法染色，DAB顯色，蘇木素復染。梯度酒精脫水，中性樹脂封片。以PBS液代替一抗為陰性對照。陽性染色為細胞內棕黃色顆粒。對各組進行灰度值測定，以背景灰度值與陽性灰度值之差作為每組灰度值。

2 結果

2.1 HRCEC的培養(yǎng)與鑒定 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài):HRCEC呈現(xiàn)鋪路石樣單層貼壁生長(圖1)。運用免疫細胞化學方法鑒定:經第Ⅷ因子相關抗原抗體染色，HRCEC胞漿中有棕黃色著色(圖2)，陰性對照組無著色，均證實體外成功培養(yǎng)出HRCEC。

2.2 MTT檢測丙丁酚對HRCEC增殖的影響MTT比色法檢測顯示不同濃度丙丁酚處理對數(shù)生長期的HRCEC培養(yǎng)24 h，在相同培養(yǎng)時間條件下，低糖對照組與高糖對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(表1，P=0.067＞0.05)。不同濃度丙丁酚對HRCEC增殖有明顯抑制作用，隨著丙丁酚濃度的逐漸提高，細胞存活率逐漸下降，而細胞抑制率逐漸升高。含不同濃度丙丁酚組吸光度A值明顯降低，與高糖對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)，并且含不同濃度丙丁酚組中各組之間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)。

Figure 1 HRCEC fused into cobblestone-like single layer HRCEC融合成單層，猶如鋪路石

Figure 2 Primary cultured HRCEC showed positive staining forⅧmonoclonal antiboby 原代培養(yǎng)的HRCECⅧ因子抗體染色陽性

表1 丙丁酚對HRCEC增殖的影響Table 1 Effect of probucal on proliferation of HRCEC (s，n=6)

表1 丙丁酚對HRCEC增殖的影響Table 1 Effect of probucal on proliferation of HRCEC (s，n=6)

Group A570Inhibiting rate/% 0 0.101 5±0.009 4 / GL 0.917 2±0.011 6 / G0 0.931 7±0.012 3 / G1 0.862 8±0.011 1 8.40 G2 0.760 8±0.010 3 20.84 G3 0.645 5±0.022 1 34.90 G4 0.560 0±0.010 9 45.32 G50.477 5±0.010 6 55.38

2.3 丙丁酚對HRCEC中VEGF表達的影響

2.3.1 免疫細胞化學檢測結果 VEGF定位于胞膜和胞漿，陽性部分為棕黃色顆粒，低糖對照組、高糖對照組與高糖+丙丁酚濃度分別為5 μmol·L－1、40 μmol·L－1、80 μmol·L－1作用于HRCEC 24 h，免疫細胞化學背景灰度值與陽性灰度值之差分別為28.75±3.77、71.93±8.37、54.67±4.33、41.43± 3.45、29.18±3.37。與高糖對照組相比，加藥組作用24 h VEGF表達明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(圖3-圖5，均為P＜0.05)，且呈質量濃度依賴性，胞漿內陽性顆粒隨著藥物作用濃度的增加而減少，顏色逐漸變淡。與低糖對照組相比，高糖對照組VEGF的表達明顯增加(P＜0.05)，胞膜及胞漿內陽性顆粒較密集，顏色較深。

Figure 3 Expression of VEGF in HRCEC in high glucose group高糖對照組HRCEC中VEGF的表達

Figure 4 Expression of VEGF in HRCEC in 40 μmol·L－1probucal+high glucose group 高糖+40 μmol·L－1丙丁酚組HRCEC中VEGF的表達

Figure 5 Expression of VEGF in HRCEC in high glucose+80 μmol·L－1probucal group 高糖 +80 μmol·L－1PBC組HRCEC中VEGF的表達

3 討論

DR是糖尿病微血管病變的重要并發(fā)癥之一，發(fā)病機制目前并不完全清楚。目前認為，高血糖除通過經典的多元醇途徑、糖基化終末產物(AGE)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑和己糖胺途徑促進DR的進展外，多種細胞因子如VEGF、HIF-1、腫瘤壞死因子等在糖尿病新生血管形成中起作用［5］。增生性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是DR致盲的主要原因，新生血管是其標志性的病理改變。在PDR患者房水或玻璃體液中，促血管新生因子水平如VEGF、細胞因子、生長因子等顯著升高［6-8］，其中VEGF可能起著最關鍵的作用［8］。研究表明，VEGF具有促進血管通透性增加、導致細胞外基質變性、誘導血管內皮細胞遷移增殖和血管形成等作用［9］，而血管內皮細胞的活動是新生血管形成的中心環(huán)節(jié)，任何體內體外的因素作用于血管內皮細胞都可以影響血管新生的過程。相應的治療如激光光凝、經瞳孔光動力學治療及玻璃體手術等，雖有一定的療效，但同時存在許多不良反應和局限性［10-12］。研究表明，單獨滅活VEGF即可廣泛抑制生理性和病理性新生血管形成［13］。因此，抗血管新生因子尤其是抗VEGF及其受體的研究具有很大意義［8］。

丙丁酚是臨床常用的降脂藥，其藥理學作用: (1)具有顯著降低血漿膽固醇并促進膽固醇逆轉運; (2)抗氧化作用:丙丁酚除能有效抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化外，Iqbal等［14］發(fā)現(xiàn)丙丁酚能有效抑制微粒體膜脂質過氧化DNA損傷;(3)改善內皮功能，選擇性抑制黏附因子表達、減少細胞間黏附［15］;(4)抗炎作用:丙丁酚能夠通過減少巨噬細胞分泌白介素-1(interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達，抑制黏附分子的表達［16］;(5)抑制內膜增生和血管重構，Tanous等［17］實驗發(fā)現(xiàn)，丙丁酚通過促進內膜重建，能夠有效地抑制支架內的血栓形成;(6)丙丁酚和胰島素聯(lián)合應用，可顯著提高胰島素的治療效果和降低并發(fā)癥的發(fā)生［18］。本實驗將丙丁酚作用于體外培養(yǎng)的高糖下HRCEC，觀察其對HRCEC細胞增殖和VEGF表達的影響。通過MTT比色法檢測不同濃度的丙丁酚作用24 h對原代培養(yǎng)的HRCEC的增殖抑制，結果表明丙丁酚對高糖下HRCEC增生抑制率呈明顯的質量濃度依賴趨勢。免疫細胞化學方法檢測正常低糖及不同濃度的丙丁酚作用下的高糖下的HRCEC中 VEGF的表達，結果發(fā)現(xiàn)高糖條件下HRCEC中VEGF的表達明顯增加，丙丁酚能下調高糖下HRCEC中VEGF表達，濃度為5 μmol·L－1時起作用，到達80 μmol·L－1時下調作用明顯。我們推測丙丁酚抑制高糖下HRCEC的增殖可能是通過下調 VEGF的表達而發(fā)生作用。但丙丁酚下調VEGF表達的信號通路及具體作用調控點尚待進一步研究。

綜上所述，丙丁酚能抑制高糖下HRCEC的增殖并下調其VEGF的表達，丙丁酚對預防RNV的形成、發(fā)展具有重要的積極意義。

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