張勝男 夏麗坤 胡 媛

在小鼠角膜石蠟標(biāo)本制作過程中,由于角膜組織的特殊性,是較為致密的組織,并且角膜每一層之間的連接不是非常緊密,這就使得石蠟切片的制作存在一定的問題。而常規(guī)方法制作切片過程中又極易出現(xiàn)眼球變形、角膜各層次結(jié)構(gòu)分離等問題。在常規(guī)的固定、脫水過程中角膜各層組織由于收縮率的不同容易造成組織分離,特別是造成角膜的分離甚至脫落,組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞著色不均。本研究,我們結(jié)合了角膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及以往的文獻(xiàn)報(bào)道[1-5],比較了幾種不同的固定方法,總結(jié)出了比較適合小鼠角膜組織的固定方法,能在不影響免疫組織化學(xué)特性的前提下有效提高小鼠角膜組織切片的質(zhì)量。現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和固定液 取4～6周齡雌性BALB/ C小鼠 30只,體質(zhì)量 15～18 g(中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)。固定液1(FAA固定液):體積分?jǐn)?shù)95%乙醇85m L,體積分?jǐn)?shù) 10%中性甲醛10 m L,冰醋酸5mL充分混勻[6]。固定液 2:多聚甲醛 4 g,加入0.1mol·L-1磷酸緩沖液80m L,加熱至60℃左右,持續(xù)攪拌,使粉末完全溶解,加少許 1 mol·L-1NaOH澄清。待冷卻后,加冰醋酸5mL、丙酮10mL,用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液補(bǔ)足至100 mL[1]。固定液3:無水乙醇60m L,體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛10 m L,冰醋酸10mL,氯仿20mL,充分混勻。

1.2 取材和固定 脫頸法處死小鼠,手術(shù)顯微鏡下取出眼球,用角鞏膜剪剪去眼球周圍組織,按不同的固定方法分為 3組:A組 20只眼球,用固定液 1固定;B組20只眼球,用固定液2固定;C組20只眼球,用固定液 3固定。所有標(biāo)本固定 2 h后,在手術(shù)顯微鏡下去除鞏膜、虹膜、晶狀體,完整保留角膜。繼續(xù)將角膜標(biāo)本置于固定液中。24 h后進(jìn)行脫水,體積分?jǐn)?shù)分別為 70%、80%、90%乙醇各脫水 1 h,體積分?jǐn)?shù) 95%乙醇脫水1 h。無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各脫水10 min,二甲苯透明 3～4 min,60℃石蠟浸蠟 2 h,矢狀位包埋眼球。切片厚 4μm,60℃烤片1 h。

1.3 HE染色 各組標(biāo)本取切片進(jìn)行HE染色。常規(guī)石蠟切片脫蠟至水,蘇木素染色 10 min,體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化1min,自來水返藍(lán)30min,10 g· L-1伊紅染色 40 s,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測

1.4.1 試劑及顯色試劑盒 一抗工作液HVEM (Herpes virus entrymediator;抗體購自Santa Cruz Biotechnology)。S-P超敏試劑盒購自福州邁鑫生物技術(shù)公司。PBS、DAB顯色劑購自北京中杉公司。已有研究發(fā)現(xiàn)HVEM在正常小鼠角膜內(nèi)皮及上皮中有表達(dá)[7]。

1.4.2 操作步驟 常規(guī)脫蠟和水化組織片后,用體積分?jǐn)?shù)3%H2O2孵育10min。再次水化后,高壓修復(fù)2min。PBS(pH 7.4)洗滌3次,每次3min。加入相應(yīng)動(dòng)物非免疫血清封閉30 min,然后加以PBS稀釋配制的一抗工作液(CD160稀釋倍數(shù)為體積比1∶400,LIGHT稀釋倍數(shù)為體積比1∶400,BTLA稀釋倍數(shù)為體積比 1∶200),4℃下過夜。PBS洗滌后,加以生物素標(biāo)記的IgG,室溫下放置30min。PBS洗滌后,加以SABC試劑室溫下放置30 min。再以PBS洗滌后,用DAB染色。鏡下控制顯色強(qiáng)度,顯色完成后蘇木素復(fù)染10min,自來水返藍(lán)20 min,常規(guī)脫水后封片。以PBS替代一抗做陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 肉眼可以看到小鼠角膜經(jīng)過固定和脫水后A組部分角膜皺縮變形;B組、C組角膜外形均無明顯變化,無皺縮和凹陷變形,能保持原有的形態(tài)。

2.2 HE染色 A組標(biāo)本染色鮮明,角膜各層結(jié)構(gòu)清楚,但是角膜基質(zhì)層出現(xiàn)明顯脫水現(xiàn)象,角膜成纖維細(xì)胞間出現(xiàn)較大空隙(圖1)。B組標(biāo)本未見明顯脫水現(xiàn)象,但角膜結(jié)構(gòu)過度壓縮,出現(xiàn)明顯的脫片現(xiàn)象,不能清晰顯示角膜各層結(jié)構(gòu)(圖2)。而C組標(biāo)本可觀察到角膜各層組織結(jié)構(gòu)完整,無明顯結(jié)構(gòu)改變,未見脫片及基質(zhì)層脫水現(xiàn)象,角膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰無裂隙;無細(xì)胞過度收縮和膨脹,細(xì)胞核仁、核膜清晰,染色質(zhì)均勻,色澤亮麗,顏色對比明顯(圖3)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 3組無明顯差異,角膜上皮及內(nèi)皮細(xì)胞均顯示HVEM陽性。但是A組標(biāo)本中組織結(jié)構(gòu)較疏松,散在很多裂隙,是基質(zhì)層細(xì)胞明顯脫水的表現(xiàn)(圖4)。B組標(biāo)本中角膜組織明顯脫片并且出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的過度壓縮,影響結(jié)果的觀察(圖 5)。而 C組標(biāo)本角膜組織結(jié)構(gòu)緊密,染色均勻,組織的免疫組織化學(xué)特性較好(圖6)。

3 討論

小鼠角膜的三層結(jié)構(gòu)為:上皮層、基質(zhì)層、內(nèi)皮層。小鼠角膜屬于較為致密的組織,而且這三層角膜結(jié)構(gòu)的密度并不完全相同,對染液及不同濃度乙醇的處理發(fā)生的反應(yīng)不同,將會(huì)造成組織間相互影響,導(dǎo)致最終病理切片的脫水,甚至脫片。國內(nèi)病理技術(shù)工作者在眼球制片技術(shù)上改進(jìn)方法較多[1-2],但步驟繁瑣,材料要求特殊、購置困難且所用部分試劑毒性大、費(fèi)時(shí)。

在小鼠角膜病理制片過程中,FAA固定液中含有冰醋酸和乙醇,冰醋酸對組織的穿透力強(qiáng),但會(huì)使組織膨脹,一般不單獨(dú)用于固定組織,并且固定時(shí)間要短,乙醇對組織有收縮作用,可以抵消冰醋酸對組織的膨脹[3]。本次我們的研究發(fā)現(xiàn),FFA固定液固定后的標(biāo)本脫水情況較為嚴(yán)重,造成了角膜組織的過度收縮。出現(xiàn)這種情況可能是由于體積分?jǐn)?shù) 95%乙醇收縮作用太強(qiáng),過多地抵消了冰醋酸對組織的膨脹作用。固定液 2中加入丙酮,且本固定液較為溫和,組織收縮不明顯,但是角膜在經(jīng)過了脫水后,會(huì)變得更為致密,導(dǎo)致了脫片情況的發(fā)生。固定液 3中無水乙醇有強(qiáng)烈的收縮作用,體積分?jǐn)?shù) 10%中性甲醛固定液滲透壓較高,在固定過程中容易使角膜水分析出,而冰醋酸可以抵消無水乙醇的收縮作用,氯仿可以抵消一部分中性甲醛的滲透壓,達(dá)到較好的角膜固定效果。固定液 3在小鼠角膜病理制片過程中的效果明顯優(yōu)于FFA固定液及固定液 2。并且方法操作較為簡單,即使在使用普通試劑的情況下,也能達(dá)到較為理想的效果,切片完整,角膜各層組織清楚,是固定小鼠角膜組織、制作病理切片的較好方法。

Figure 1 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 1showed corneal tissues were dehydrated(HE,×400).Figu re 2 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 2 showed corneal sections were flaked and broke into pieces(HE,×400).Figure 3 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 3 showed the structures were clear(HE,×400) 圖1 固定液1固定角膜組織HE染色,角膜組織脫水(HE,×400)。圖2 固定液2固定角膜組織HE染色,角膜組織脫片(HE,×400)。圖3 固定液3固定角膜組織HE染色,角膜組織結(jié)構(gòu)清晰(HE,×400)

Figure 4 Immunohistochemistry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 1(×400).Figure 5 Immunohistochemistry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 2(×400).Figure 6 Immunohistochem istry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 3(×400) 圖4 固定液1固定角膜免疫組織化學(xué)HVEM染色(×400)。圖5 固定液2固定角膜免疫組織化學(xué)HVEM染色(×400)。圖6 固定液3固定角膜免疫組織化學(xué)HVEM染色(×400)

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