勞惠燕 王蔚淼 李小梅 李續(xù)娥

草魚養(yǎng)殖中一直面臨病害多、死亡量大的問題，而采用抗生素和化學(xué)藥物防治又會造成耐藥性和藥物殘留超標(biāo)。因此，研發(fā)天然無公害、能有效提高草魚抗病力的免疫增強(qiáng)劑具有廣闊的前景。光合細(xì)菌是一大類在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌總稱，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有凈化水質(zhì)、促進(jìn)生長、防病治病等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌含有的細(xì)胞壁多糖和輔酶Q能明顯提高水產(chǎn)動物的免疫功能[1－3]。魚類主要依靠非特異免疫系統(tǒng)抵抗病原入侵，而關(guān)于光合細(xì)菌對草魚免疫機(jī)能的研究鮮有報(bào)道。本研究擬以一種光合細(xì)菌復(fù)合制劑為飼料添加劑飼喂草魚，探討其對草魚生長及非特異性免疫功能的影響，為開發(fā)防治魚病的益生菌制劑類藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組

光合細(xì)菌復(fù)合制劑（菌數(shù)4×109CFU/ml）和基礎(chǔ)飼料均由廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心提供。實(shí)驗(yàn)草魚（Ctenopharyngodon idellus）180余尾，初始平均體重為（32.82±0.02）g，購回后置于水族箱中暫養(yǎng)22 d，之后隨機(jī)平分為2組：①對照組，只飼喂基礎(chǔ)飼料；②處理組，將光合細(xì)菌制劑按1%比例噴灑于基礎(chǔ)飼料上拌勻飼喂。每組各設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚。草魚飼喂過程中每日定時(shí)定量飼喂2次，并記錄攝食量，其它養(yǎng)殖管理按常規(guī)方式進(jìn)行。

1.2 測定方法

1.2.1 生長性能指標(biāo)的測定

分別對飼喂30 d和60 d的實(shí)驗(yàn)草魚稱重、測體長，計(jì)算生長性能指標(biāo)：

增重率(%)=[(試驗(yàn)?zāi)┚兀囼?yàn)初均重)/試驗(yàn)初均重]×100；

體長增長率(%)=(試驗(yàn)?zāi)w均長－試驗(yàn)初體均長)/試驗(yàn)初體均長×100；

特定生長率(%/d)=(ln試驗(yàn)?zāi)┚兀璴n試驗(yàn)初均重)/試驗(yàn)天數(shù)×100；

飼料系數(shù)=均攝食量/(試驗(yàn)?zāi)┚兀囼?yàn)初均重)；

蛋白質(zhì)效率=[(試驗(yàn)?zāi)┛傮w重－試驗(yàn)初總體重)/(飼料中的蛋白質(zhì)含量×攝取飼料總重量)]。

1.2.2 非特異性免疫指標(biāo)的測定

對飼喂30 d和60 d的實(shí)驗(yàn)草魚稱重、測體長后，取血樣和肝臟（取樣前1 d停止投喂）。血樣采用穿刺尾動脈取血法取血，每組取15尾魚，采集的血樣部分以2 g/l的肝素鈉抗凝，其余分離血清。血清和肝臟均保存于－20℃冰箱中備用。

1.2.2.1 白細(xì)胞吞噬活性的測定

將金黃色葡萄球菌（Stapylococcus aureus，購于廣東省微生物菌種保藏中心）接種在LB培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)24 h后，3000 r/min離心5 min，集菌。然后在菌懸液中加入終濃度為1%的福爾馬林，37℃下滅活24 h（經(jīng)過平皿法證實(shí)此菌已被徹底滅活），用滅菌生理鹽水（0.65%）清洗2次，并調(diào)成為濃度為10%的菌懸液，即為福爾馬林滅活的菌體，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，作為檢測白細(xì)胞吞噬活性的吞噬原。

將0.2 ml抗凝血加入0.1 ml金黃色葡萄球菌懸液，充分混勻后置于28℃下水浴，孵育1 h。水浴期間每隔10 min搖勻1次。靜置，吸取紅細(xì)胞與上層血漿之間的白細(xì)胞層，每個(gè)血樣涂5片。自然晾干后，滴加甲醇固定，Wright's－Giemsa染色10 min，蒸餾水沖洗，風(fēng)筒吹干后油鏡觀察。計(jì)數(shù)并計(jì)算白細(xì)胞的吞噬百分比(PP)與吞噬指數(shù)(PI)。

PP（%）=（100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100）×100；

PI=吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/參與吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.2.2 血清抗菌活力的測定

用0.1 mol/l pH值6.4的磷酸鹽緩沖液從固體培養(yǎng)基上將熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，購于廣東省微生物菌種保藏中心）洗下作為底物并配成OD570=0.3～0.5的菌懸液。取3 ml該懸液與50 μl待測血清于試管中混勻，測570 nm處的光密度值（A0）。然后在37℃溫水浴中30 min，取出后放入冰箱(4℃)10 min終止反應(yīng)，測定570 nm處的光密度（A），抗菌活力（Ua）按公式計(jì)算：Ua=(A0－A)/A0。

1.2.2.3 SOD、MDA、GSH－Px的測定

均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定（批號為20100712），具體測定步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行t檢驗(yàn)分析差異性。

2 結(jié)果

2.1 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚生長性能的影響

用添加光合細(xì)菌復(fù)合制劑的飼料飼喂草魚60 d時(shí)，草魚的生長性能指標(biāo)變化如表1所示。從表1可知，處理組草魚增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率較對照組分別提高了2.68%、2.03%、4.72%，飼料系數(shù)降低了4.78%，體長增長率降低了4.63%。雖然這種差異不具有顯著性意義（P＞0.05），但添加光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率增加及飼料系數(shù)降低的趨勢對草魚的養(yǎng)殖卻是十分有意義的。此外，處理組草魚增重率增加與體長增長率降低，提示添加光合細(xì)菌復(fù)合制劑有可能促進(jìn)草魚的體形增肥。

表1 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚生長的影響

2.2 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚非特異性免疫的影響（見表2）

光合細(xì)菌復(fù)合制劑作為飼料添加劑對草魚PP，PI，血清抗菌活力，血清及肝臟總SOD活力、MDA含量、GSH－Px活力共9個(gè)非特異性免疫指標(biāo)的影響情況如表2所示。由表2可知，飼喂30 d時(shí)，處理組較對照組提高草魚白細(xì)胞吞噬百分比29.6%，具有極顯著差異（P＜0.01），到飼喂60 d時(shí)，處理組與對照組白細(xì)胞吞噬百分比則無顯著性差異（P＞0.05）；飼喂30 d或60 d時(shí)，處理組與對照組的吞噬指數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。處理組與對照組的血清抗菌活力在飼喂30 d時(shí)無顯著性差異（P＞0.05），但在飼喂60 d時(shí)，處理組極顯著升高（P＜0.01）。

表2 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚非特異性免疫的影響

飼喂30 d或60 d時(shí)，與對照組相比，處理組草魚血清總SOD活力均極顯著升高（P＜0.01），但肝臟總SOD活力僅在飼喂60時(shí)有極顯著升高（P＜0.01）；飼喂30 d時(shí)，處理組血清及肝臟GSH－Px活力均極顯著升高（P＜0.01），飼喂60 d時(shí)，處理組與對照組的該指標(biāo)則不具顯著性差異（P＞0.05）。飼喂60 d時(shí)，處理組草魚血清MDA含量較對照組顯著升高（P＜0.05），但肝臟MDA含量沒有顯著性變化（P＞0.05）。

3 討論

3.1 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚生長性能的影響

光合細(xì)菌能有效利用水中過剩的有機(jī)物作為自身繁殖的營養(yǎng)源，迅速分解水中有害物質(zhì)，增加溶氧，穩(wěn)定水質(zhì)，為水生生物創(chuàng)造良好的生態(tài)環(huán)境；其菌體的營養(yǎng)成分十分豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)65.45%，維生素含量豐富、齊全[4]，有很好的促生長作用。沈錦玉等[5]在飼料中添加1%或5%的光合細(xì)菌飼喂鯽魚、羅非魚48 d，得出魚的生長速度高于對照組的結(jié)論；Wang Yanbo等[6]的研究結(jié)果表明，飼料中添加0.1%光合細(xì)菌凍干粉飼養(yǎng)鯉魚60 d能顯著提高其日增重、相對增重率和降低飼料系數(shù)。本試驗(yàn)飼料中添加1%的光合細(xì)菌復(fù)合制劑飼養(yǎng)草魚60 d對其生長沒有顯著影響，這可能與光合細(xì)菌的種類及添加劑量、魚的食性以及養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。

3.2 光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚非特異性免疫的影響

飼料中的微生態(tài)制劑通過刺激機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫功能提高水產(chǎn)動物的抗病力，如白細(xì)胞吞噬活性、抗菌活力、溶菌酶活力、補(bǔ)體活性、過氧化物酶活力等。

魚類白細(xì)胞的主要作用是吞噬病菌和自身的老化與壞死細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體抵御病害的侵襲。王有基等[7]每7 d給鯉魚投放不同濃度的光合細(xì)菌菌液，在第1、7、14、21、28 d檢測鯉魚白細(xì)胞吞噬活性等指標(biāo)，測得處理組白細(xì)胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)明顯高于對照組（P＜0.05），且隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)；趙衛(wèi)紅等[8]的研究結(jié)果也表明，在水體中添加光合細(xì)菌飼養(yǎng)異育銀鯽49 d能提高其白細(xì)胞的免疫性能，作用效果隨著添加量的增加而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌復(fù)合制劑飼喂草魚30 d時(shí)提高草魚白細(xì)胞吞噬百分比29.6%，而60 d時(shí)處理組與對照組沒有顯著差異，可能是因?yàn)楣夂霞?xì)菌對魚類白細(xì)胞吞噬活性的刺激作用主要在投放的早期、持續(xù)時(shí)間較短的緣故。

SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2－），保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本研究表明，飼喂草魚30 d時(shí)，處理組血清SOD活力提高了26.8%，60 d時(shí)血清SOD活力提高12.5%，肝臟SOD活力提高19.5%，血清抗菌活力提高58.3%，劉慧玲等[9]的研究結(jié)果也表明，光合細(xì)菌能顯著提高羅非魚組織SOD活力和抗菌活力，與本研究的結(jié)果一致。GSH－Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。關(guān)于光合細(xì)菌對魚類GSH－Px活力的影響，目前尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道，而其它微生態(tài)制劑對水產(chǎn)動物GSH－Px活力的影響則有相關(guān)報(bào)道。Deng－Yu Tseng等[10]測定枯草芽孢桿菌對白對蝦的免疫參數(shù)的影響，GSH－Px活力是指標(biāo)之一，但各處理組之間沒有顯著差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光合細(xì)菌復(fù)合制劑在飼喂草魚30 d時(shí)極顯著提高草魚血清和肝臟GSH－Px活力，60 d時(shí)與對照組沒有顯著差異，推測其對GSH－Px活力的刺激作用可能也在早期。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，它的含量高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在正常生物體內(nèi)，氧自由基的產(chǎn)生與清除可維持低水平的，有利無害的平衡[11]。本研究中飼喂草魚60 d時(shí)，血清處理組MDA含量反而比對照組顯著升高了，說明受自由基攻擊的程度高，這可能是機(jī)體要與血清中極顯著升高的清除自由基的SOD平衡的緣故。菌種來源、類型、劑量和使用時(shí)間等各種因素會顯著影響微生態(tài)制劑的免疫調(diào)節(jié)活力。由于微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在最適宜劑量，且最適宜劑量會因免疫對象和免疫指標(biāo)的類型而不同，不同組織或器官的特定免疫反應(yīng)的作用也會隨著使用劑量而變化。免疫刺激劑的用量與免疫刺激作用并不存在正相關(guān)，高劑量或者是長時(shí)間的投喂反而會抑制免疫反應(yīng)[12-13]。因此，光合細(xì)菌復(fù)合制劑對草魚的最佳免疫時(shí)間和使用劑量還有待進(jìn)一步研究。

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