易中華 朱年華 黎觀紅 宋小珍 潘 珂 瞿明仁

采用體外發(fā)酵技術(shù)評價(jià)日糧纖維的營養(yǎng)價(jià)值（Tilley等，1963），在反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)上已經(jīng)有40多年的歷史。Ehle等（1982）將這項(xiàng)試驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用到人體大腸微生物體外發(fā)酵膳食纖維上。體外發(fā)酵法具有如下優(yōu)點(diǎn)：發(fā)酵條件一致、發(fā)酵時(shí)間一致、能夠準(zhǔn)確測定發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量、試驗(yàn)費(fèi)用低廉。體外發(fā)酵試驗(yàn)一直存在爭議的是，使用糞樣作為發(fā)酵菌源得出的結(jié)果能否代表腸道內(nèi)微生物利用纖維的能力。Sunvold等（1995a、b、c、d） 結(jié)合體內(nèi)腸道對日糧纖維的發(fā)酵，用豬、貓、狗、馬、牛、人等的新鮮糞樣作為發(fā)酵菌源，系統(tǒng)研究了甜菜渣、果膠、瓜爾膠、纖維素等幾種日糧纖維的發(fā)酵特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以新鮮糞樣作為體外發(fā)酵的菌源，有機(jī)物質(zhì)消失率的測定值與體內(nèi)試驗(yàn)測定值具有很好的相關(guān)性。Vickers等（2001）用狗盲腸菌源，比較了菊粉、果寡糖和幾種日糧纖維的體外發(fā)酵特點(diǎn)，結(jié)果表明，菊粉和果寡糖的發(fā)酵性很高，甜菜渣、甘露寡糖和大豆纖維具有中等程度的發(fā)酵性，纖維素的發(fā)酵性最低。但上述試驗(yàn)的日糧纖維成分中還含有很多蛋白質(zhì)等非纖維類成分，這勢必對發(fā)酵結(jié)果造成干擾。

本試驗(yàn)的目的是采用飼喂無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸菌源，通過體外發(fā)酵玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素，比較其短鏈脂肪酸的產(chǎn)量及產(chǎn)生速率，為評價(jià)不同飼料中非淀粉多糖（NSP）的體外發(fā)酵特性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及菌源

選用48只1日齡AA肉公雞，隨機(jī)分成6個(gè)籠，每籠8只雞。試驗(yàn)日糧參照NRC（1994）家禽營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)，配制為玉米-大豆?jié)饪s蛋白型日糧，不含任何抗生素，以粉料形式飼喂。試驗(yàn)雞籠養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)管理和免疫程序參照AA肉仔雞飼養(yǎng)手冊進(jìn)行。試驗(yàn)第42 d 8:00從每籠中隨機(jī)抓取2只試雞，肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉后，將試雞宰殺，剖開腹腔，取出盲腸，結(jié)扎固定盲腸近端，自結(jié)扎外側(cè)剪斷，用硫酸紙包扎，置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.2 非淀粉多糖的來源及制備

非淀粉多糖來源于濾紙纖維及玉米、豆粕、小麥和麥麩等4種飼料原料。以濾紙纖維作為純纖維素的來源。參照Choct等（1992）的方法，從玉米、豆粕、小麥和麥麩等飼料原料中提取堿溶性NSP。

①將1 kg欲提取NSP的飼料樣品粉碎（過60目篩），溶解在10 L熱水中，加入α－淀粉酶1.5 ml置于80～100℃的水浴槽中培養(yǎng)1 h，以降解飼料樣品中的淀粉。

②冷卻后，加入5 g胰蛋白酶（Sigma公司）于50℃的水浴槽中培養(yǎng)1 h，以除去飼料樣品中的蛋白質(zhì)。

③培養(yǎng)后以1000×g轉(zhuǎn)速離心30 min。

④去除上清液，將殘留物加入等體積的0.2 M氫氧化鈉溶液，于80℃的水浴槽中培養(yǎng)2 h。

⑤利用0.2 M醋酸調(diào)整至pH值為7，并以1000×g轉(zhuǎn)速離心30 min。

⑥除去上清液后，再加入4倍體積的80%（v/v）乙醇溶液混和，再以13000×g轉(zhuǎn)速離心30 min。

⑦取出沉淀物后，轉(zhuǎn)移至60℃干燥箱中干燥，即可得到NSP。

1.3 發(fā)酵程序與樣品采集

1.3.1 培養(yǎng)液的配置

培養(yǎng)液的配方參照Sunvold等(1995)的方法配置。

表1 培養(yǎng)液的配方

1.3.2 發(fā)酵底物處理

稱取0.3 g底物（準(zhǔn)確至0.001 g），放入250 ml葡萄糖瓶中，加入30ml培養(yǎng)液，于121℃高壓滅菌20min。每種發(fā)酵底物按一式三份處理，設(shè)為3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 菌源的處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

將取回來的盲腸食糜樣品在超凈臺室溫解凍，用預(yù)先配置好的培養(yǎng)液以1：10（重量與體積之比）的比例稀釋混勻后，用200目尼龍網(wǎng)過濾，取濾液，將濾液密封于250 ml葡萄糖瓶中，沖入CO2使其保持在厭氧環(huán)境中。

1.3.4 菌源對底物的發(fā)酵

向每個(gè)裝有底物的葡萄糖瓶中加入1 ml處理好的菌源，沖入CO2，密封，放入37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6、12、24 h。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取上清液樣4 ml，用于測定發(fā)酵液的SCFA產(chǎn)量和pH值。

1.4 測試指標(biāo)及方法

1.4.1 飼料原料的纖維成分分析

參照Lee等(1992)的酶分解比重法，分析玉米、豆粕、小麥和麥麩等4種飼料原料及其NSP提取物所含的總?cè)占Z纖維（TDF）、可溶性日糧纖維（SDF）與不可溶性日糧纖維（IDF）的含量。采用張麗英（2003）的方法，測定4種飼料原料及其NSP提取物的干物質(zhì)（DM）、粗纖維（CF）和粗蛋白質(zhì)（CP）的含量。

1.4.2 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度的測定

參照Carre等（1995）的方法，用Hewelett Packard 6890型氣相色譜儀測定腸道內(nèi)容物中乙酸、丙酸和丁酸的濃度。取上清液1 ml于塑料安培管中，加入1 ml的25%偏磷酸溶液，蓋緊蓋子，振蕩搖勻，并置冰水浴中30 min；25000×g離心20 min，取上清液，上機(jī)測樣。上機(jī)氣相色譜條件見儀器說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后，采用SPSS 16.0軟件中的One－Way ANOVY程序進(jìn)行方差分析和Duncan's法多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的纖維成分分析

玉米、小麥、豆粕和麥麩等4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的日糧纖維組成見表2。在飼料原料組成中，總?cè)占Z纖維或粗纖維的含量均以小麥麩為最高，總?cè)占Z纖維含量以玉米為最低，粗纖維含量以小麥為最低，且所有原料粗纖維的含量均遠(yuǎn)低于總?cè)占Z纖維的分析值；在總?cè)占Z纖維的比例中，可溶性纖維所占比例以小麥（22.07%）為最高，豆粕（20.37%）次之，小麥麩（12.16%）最低。按Choct等(1992)的方法提取玉米、小麥、豆粕和麥麩中NSP，其提取量分別為8.37%、16.48%、36.14%、50.53%均高于飼料原料中總?cè)占Z纖維的分析值。在堿溶性NSP提取物組成中，除豆粕NSP提取物粗蛋白含量高達(dá)15.45%外，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低；總?cè)占Z纖維含量大幅度高于原料，且不同NSP提取物之間總?cè)占Z纖維含量的差距變小；可溶性纖維占總?cè)占Z纖維的比例仍以小麥NSP為最高，豆粕NSP次之，小麥麩NSP最低。

表2 飼料原料的日糧纖維與其堿溶性非淀粉多糖提取物的組成（%，風(fēng)干基礎(chǔ)）

2.2 非淀粉多糖體外發(fā)酵后短鏈脂肪酸產(chǎn)量和組成比例的比較

表3為肉仔雞盲腸食糜菌源體外發(fā)酵玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素在6、12、24 h后短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)量及組成比例。小麥NSP提取物的SCFA產(chǎn)量及生成速率最大；豆粕NSP提取物次之，第6、12、24 h的SCFA總產(chǎn)量分別為小麥NSP提取物的65.38%、65.07%、71.76%；玉米NSP提取物和小麥麩NSP提取物緊隨豆粕NSP提取物之后，第6、12、24 h的SCFA總產(chǎn)量分別為小麥NSP提取物的 61.53%、57.53%、62.75%和 55.77%、44.52%、45.10%；纖維素的可發(fā)酵性最差，第12、24 h的SCFA總產(chǎn)量僅為小麥NSP提取物的10.96%～14.90%?？傊?，5種NSP的可發(fā)酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。

此外，上述NSP發(fā)酵產(chǎn)物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數(shù)發(fā)酵底物在第24 h產(chǎn)生丁酸的比例明顯增多。

3 討論

3.1 4種飼料原料及其堿溶性NSP提取物的纖維成分分析

飼料原料中日糧纖維除構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素外，其它成分因原料不同而有所差異。玉米和小麥中日糧纖維以阿拉伯木聚糖為主，在雙子葉豆科植物中如大豆則主要為半乳甘露聚糖與酸性果膠物質(zhì)。本試驗(yàn)分析結(jié)果表明，在總?cè)占Z纖維的比例中，可溶性纖維所占比例以小麥NSP為最高，豆粕NSP次之，小麥麩NSP最低。

表3 肉仔雞盲腸食糜菌源發(fā)酵非淀粉多糖6、12、24 h后短鏈脂肪酸產(chǎn)量

Van Laar(2000)提取不同來源單子葉與雙子葉植物胚乳細(xì)胞壁時(shí)，在單子葉植物（小麥、裸麥及玉米）細(xì)胞壁中所含的蛋白質(zhì)量一般值都很低，而在雙子葉植物一般約為4%左右，但大豆粕細(xì)胞壁上含有相當(dāng)高的蛋白質(zhì)。在NSP提取過程中，原料中存在不被酶液消化的蛋白質(zhì)，以豆粕尤為明顯。這是由于豆粕中的蛋白質(zhì)與NSP結(jié)合的比例較大，纖維與多糖類能將蛋白質(zhì)包覆，進(jìn)而使消化酶難以分解（Carre等，1985），導(dǎo)致NSP提取物中仍存在較大比例的未消化蛋白質(zhì)。在本試驗(yàn)中，豆粕NSP提取物粗蛋白含量為14.45%，大大低于Van Laar(2000)的報(bào)道，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低。這有利于減少蛋白質(zhì)對NSP提取物發(fā)酵的影響。

3.2 非淀粉多糖體外發(fā)酵后短鏈脂肪酸產(chǎn)量和組成比例的比較

肉仔雞由于后腸較短，通常認(rèn)為其對日糧纖維的發(fā)酵能力很有限。但近年來，隨著功能性寡糖和無抗生素日糧研究的深入，發(fā)達(dá)國家（尤其是歐盟）正在嘗試通過改變?nèi)占Z纖維組成或添加外源性非消化寡糖來改善動(dòng)物腸道微生態(tài)系統(tǒng)，以達(dá)到降低甚至停用飼用抗生素（Bedford，2000；Verstegen 等，2002）的目的，并在此基礎(chǔ)上提出了功能性纖維的概念（Prosky,2000;Guillon等,2000;Varley,2004）。因此，有必要認(rèn)識和評價(jià)肉仔雞腸道微生物對非消化寡糖和日糧纖維的發(fā)酵利用。

體外發(fā)酵技術(shù)具有發(fā)酵條件一致、發(fā)酵時(shí)間一致、能夠準(zhǔn)確測定發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量及試驗(yàn)費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，已被從反芻動(dòng)物營養(yǎng)應(yīng)用到非反芻動(dòng)物營養(yǎng)上來（Ehle等，1982；Vickers等，2001）。盲腸是消化道微生物寄居肉仔雞的主要場所，本試驗(yàn)體外發(fā)酵所使用的菌種來源于采食無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸。結(jié)果表明，玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素發(fā)酵產(chǎn)物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數(shù)發(fā)酵底物在第24 h產(chǎn)生丁酸的比例明顯增多。試驗(yàn)結(jié)果與 Sunvold等（1995a、b、c、d）和Vickers等（2001）的基本一致，但短鏈脂肪酸產(chǎn)生速率更快，這可能是肉仔雞盲腸菌群數(shù)量相對較多的原因。

本試驗(yàn)NSP的可發(fā)酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。這是由于NSP的特性不同，造成微生物對NSP的利用能力有所差異所致。小麥麩NSP和玉米NSP主要以不溶性日糧纖維為主，小麥NSP和豆粕NSP則含可溶性日糧纖維相對較多，不同特性日糧纖維影響微生物是否能侵入纖維間隙進(jìn)行水解作用。日糧纖維在降解過程中受菌種種類不同與日糧纖維組成的影響（Rao等，1994）?？扇苄匀占Z纖維較易被微生物發(fā)酵分解，因其持水性較高，使微生物容易侵入纖維間質(zhì)中，但微生物難以侵入不可溶性日糧纖維的間質(zhì)，以致無法快速降解纖維（Schneeman,1987）。Salvador等（1993）指出，當(dāng)纖維呈現(xiàn)晶體狀結(jié)構(gòu)時(shí)，能強(qiáng)烈地抵抗微生物水解酶，而小麥麩NSP為此類型的纖維結(jié)構(gòu)，因此，降解速率和SCFA產(chǎn)量較低。當(dāng)微生物無法降解纖維時(shí)，僅能產(chǎn)生較少的SCFA，進(jìn)而影響微生物的生長與代謝。另外，某些可溶性NSP具有較高的黏滯性，也會(huì)影響腸道細(xì)菌對NSP的發(fā)酵。Choct等(1999)指出，雞腸道內(nèi)容物的黏滯性增加，使食糜通過速率減慢，并增加腸道未攪拌水層的厚度，這些現(xiàn)象均會(huì)減少腸道中的含氧量，而適合厭氣菌的生長。在豆粕NSP組中，乙酸比例有較其它組高的趨勢，這是由于豆粕中的NSP與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固，本試驗(yàn)提取NSP過程中雖用蛋白酶水解豆粕中的蛋白質(zhì)，但粗蛋白仍達(dá)15.45%，這得以提供微生物利用，即以蛋白質(zhì)為發(fā)酵作用的底物，而其產(chǎn)物乃以乙酸為主，故造成豆粕中含有較高比例的乙酸。Macfarlane等(1988)指出，微生物發(fā)酵時(shí)所使用的底物會(huì)影響到SCFA產(chǎn)量，一般以蛋白質(zhì)作為發(fā)酵底物所產(chǎn)生的SCFA量會(huì)較以碳水化合物為基質(zhì)的少。

本試驗(yàn)在提取NSP過程中采用堿溶性NSP提取法，為的是保留更多的可溶性NSP。結(jié)果表明，與不可溶性NSP相比，可溶性NSP的發(fā)酵特點(diǎn)更接近于非消化寡糖。盡管如此，非消化寡糖和可溶性NSP對動(dòng)物消化生理的影響還是有其不同之處的?？扇苄訬SP溶解后，通過分子之間相互纏繞，共價(jià)或非共價(jià)鍵連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使水溶液呈現(xiàn)一定的黏滯性，這會(huì)降低胃的排空速率，影響腸道食糜的混合和營養(yǎng)素向腸道表皮細(xì)胞或吸收表面的擴(kuò)散，結(jié)果造成飼料的消化和吸收的速率全面下降（Schwartz等，1982；Lin等，1992、1997）；與可溶性NSP不同的是，非消化寡糖在水溶液一般不表現(xiàn)黏滯性，但發(fā)酵產(chǎn)生的SCFA可增加食糜的流通速率。

4 結(jié)語

在本試驗(yàn)中以采食無抗生素日糧的健康肉仔雞盲腸微生物為菌源的體外發(fā)酵條件下，以玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素為發(fā)酵底物。結(jié)果表明，上述NSP的發(fā)酵產(chǎn)物SCFA組成比例均以乙酸為最多，其次為丙酸，丁酸最少；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，丁酸比例逐漸增加，多數(shù)發(fā)酵底物在第24 h產(chǎn)生丁酸的比例明顯增多。玉米、小麥、豆粕、小麥麩等的NSP提取物及纖維素的可發(fā)酵性的順序依次為小麥NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麥麩NSP＞纖維素。