朱 丹，王 希，朱延明，陳 超，李 勇，柏 錫，才 華，紀(jì) 巍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

在基因的功能研究過程中，外源重組基因表達(dá)產(chǎn)物的功能與其在宿主細(xì)胞中的定位有重要的關(guān)系，特別是對(duì)于真核細(xì)胞，蛋白質(zhì)位于不同的細(xì)胞部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，對(duì)研究外源重組基因表達(dá)產(chǎn)物的功能或未知新基因的功能來說具有很重要的意義。目前被廣泛應(yīng)用的能進(jìn)行亞細(xì)胞定位的報(bào)告基因主要是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。綠色熒光蛋白是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的一個(gè)重要的工具，綠色熒光蛋白相對(duì)分子質(zhì)量很小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一種直觀性很強(qiáng)的遺傳標(biāo)記物[1-3]。通過與某單一序列的融合，可特異地進(jìn)行細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的定位。由于GFP基因其產(chǎn)物可以自身發(fā)光，不需要任何底物和輔助因子參與就能檢測(cè)其活性，所以用GFP進(jìn)行亞細(xì)胞定位，避免了提純蛋白、標(biāo)記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)雜方法，從而使研究蛋白在活細(xì)胞的準(zhǔn)確定位變得簡(jiǎn)單易行[4-6]。但在研究基因在植物細(xì)胞中的定位時(shí)，必須構(gòu)建與基因融合的GFP亞細(xì)胞定位載體，常常會(huì)因酶切位點(diǎn)的難以選擇使得構(gòu)建周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，如果能構(gòu)建出具有多個(gè)可用酶切位點(diǎn)的植物表達(dá)載體卡盒，將大大縮短載體構(gòu)建周期，節(jié)省大量人力物力[7-8]。

本研究通過酶切連接手段消除pCAMBIA-1302載體本身的多克隆位點(diǎn)（Multip cloning site，MCS），同時(shí)通過高保真PCR擴(kuò)增克隆了原核表達(dá)載體pET-32b的多克隆位點(diǎn)，并將此多克隆位點(diǎn)插入已消除本身多克隆位點(diǎn)的載體pCAMBIA-1302的GFP基因序列前，構(gòu)建成植物GFP亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將此載體卡盒pCEG于煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP蛋白的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)GFP蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有表達(dá)，證明此載體卡盒可用于植物基因的亞細(xì)胞定位分析；本研究所構(gòu)建的載體卡盒為目的基因的植物亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建帶來了很大的便利，也為目的基因在宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。

植物GFP亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA-1302，植物表達(dá)載體pEbTIP，原核表達(dá)載體pET-32b均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物工程研究室保存；中間表達(dá)載體pCEbT和植物GFP亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG由本研究室構(gòu)建；測(cè)序載體pGEM-T購自Promega公司。質(zhì)粒圖譜見結(jié)果與分析。

1.1.2 常用試劑及酶類

LA TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及DNA膠回收試劑盒均購自大連寶(TaKaRa)生物工程公司。卡那霉素、氨芐青霉素等其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。引物合成、DNA測(cè)序由上海生物工程公司完成。

1.1.3 植物材料

煙草品種為本氏煙。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA提取、電泳、酶切、大腸桿菌及農(nóng)桿菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化、菌落PCR

均采用常規(guī)分子生物學(xué)操作技術(shù)，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 瓊脂糖凝膠中DNA片段的回收

按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.3 連接反應(yīng)方法

具體操作步驟參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)原核表達(dá)載體pET-32b上MCS區(qū)附近的序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分析其內(nèi)部酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)MCS的克隆引物，為方便后續(xù)載體構(gòu)建，上游引物端從NcoⅠ位點(diǎn)開始設(shè)計(jì)，并在下游端加入了BglⅡ位點(diǎn)。最終確定引物序列如下:

根據(jù)載體pCEG上新插入的MCS上游區(qū)的堿基序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了一條引物用于載體卡盒pCEG中新插入的MCS的測(cè)序，其引物序列如下:

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pCEG轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCEG的農(nóng)桿菌注射培養(yǎng)4周大小的煙草葉片。

1.2.6 GFP亞細(xì)胞定位觀察

取侵染后3 d的煙草葉片，在激光共聚焦顯微鏡488 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，觀察GFP蛋白的表達(dá)情況以及亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物GFP亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA-1302中MCS的消除

用Eco RⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA-1302，消除其多酶切位點(diǎn)（MCS），同樣用Eco RⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒pEbTIP并回收切下的大小約280bp不含有常用酶切位點(diǎn)的基因片段作為小接頭，與切成線性的pCAMBIA-1302連接，構(gòu)建成中間表達(dá)載體，命名為pCEbT。將pCEbT轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并用SalⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切電泳圖結(jié)果顯示不能切下約700bp大小的條帶，證明SalⅠ酶切位點(diǎn)已被消除，即證明質(zhì)粒pCAMBIA-1302中的MCS已被消除（見圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pCEbT的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.1 Construction and characterization with endonucleases of recombination plasmid pCEbT

2.2 原核表達(dá)載體pET-32b MCS的獲得

分析原核表達(dá)載體pET-32b上MCS區(qū)附近的序列及其內(nèi)部酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)MCS的克隆引物，并在上游引物端加入NcoⅠ酶切位點(diǎn)，在下游端加入BglⅡ酶切位點(diǎn)。

以原核表達(dá)載體pET-32b為模板，采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約100bp的特異帶，即pET-32b的MCS，其堿基序列及所含的酶切位點(diǎn)如圖2所示。將得到的DNA片段與pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Amp的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，將鑒定正確的陽性克隆菌落送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。

2.3 植物GFP亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG的構(gòu)建

分析pGEM-T（含pET-32b的MCS）和pCEbT的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了pCEG構(gòu)建方案，即用BglⅡ和SphⅠ雙酶切pGEM-T（含pET-32b的MCS）并回收大小約3.1 kb的線性大片段，用BglⅡ單酶切pCEbT，將兩載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行線性連接，并回收線性連接產(chǎn)物，然后用NcoⅠ單酶切回收的線性連接產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物大片段，最后用T4DNA連接酶進(jìn)行NcoⅠ酶切產(chǎn)物的自身環(huán)化連接，構(gòu)建成最終載體卡盒pCEG（見圖3）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取陽性克隆質(zhì)粒，并用SalⅠ和PstⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示能切下大小約900bp的條帶，證明終載體卡盒pCEG中存在SalⅠ酶切位點(diǎn)，即新合成的MCS成功插到了質(zhì)粒pCEbT的GFP基因序列前面。為了進(jìn)一步驗(yàn)證終載體卡盒pCEG中新插入的MCS的正確性，在載體卡盒pCEG中新插入的MCS上游區(qū)設(shè)計(jì)了一條引物（引物序列見材料與方法）用于新插入的MCS的測(cè)序，將酶切鑒定正確的終載體卡盒pCEG和新合成的引物送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與pET-32b的MCS序列完全一致，其堿基序列所具有的酶切位點(diǎn)及順序如圖2所示，即證明終載體卡盒pCEG構(gòu)建正確。

圖2 pET-32b 的MCS堿基序列及酶切位點(diǎn)Fig.2 Base sequence and restriction enzyme cutting site of MCS in pET-32b

2.4 亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化及GFP蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為了驗(yàn)證植物亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG的可應(yīng)用性，將載體卡盒pCEG轉(zhuǎn)到根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，通過篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化了pCEG的根瘤農(nóng)桿菌EHA105對(duì)煙草葉片進(jìn)行注射，使煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)pCEG中的GFP蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，GFP蛋白在煙草葉片的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有強(qiáng)烈表達(dá)（見圖4），說明此載體卡盒可用于目的基因的亞細(xì)胞定位分析。

圖4 載體卡盒pCEG中GFP蛋白在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of GFP protein of plasmid pCEG in N.benthamiana

3 討論與結(jié)論

3.1 植物GFP亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG的通用性

由于亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG的GFP基因序列前面插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，而載體本身的多克隆位點(diǎn)已被消除，為目的基因構(gòu)建與GFP融合的蛋白提供了很多可用的酶切位點(diǎn)，為目的基因的亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建過程提供了很多便利，這將大大縮短載體構(gòu)建周期，節(jié)省大量人力物力。

由于亞細(xì)胞定位載體卡盒pCEG具有與pET-32b相同的多克隆位點(diǎn)（MCS），且位于報(bào)告基因GFP之前，任何研究的目的基因可直接從pET-32b上切下來連到卡盒pCEG上，而不會(huì)改變基因表達(dá)的編碼框，大大簡(jiǎn)化了目的基因和GFP基因構(gòu)成融合基因來用于目的基因的亞細(xì)胞定位分析的操作過程。

3.2 大載體與小片段連接策略

本研究需要將大小約0.1 kb的DNA小片段（pET-32b的MCS）連接到大小為10.7 kb的大載體上。由于小片段和大載體大小相差懸殊，若直接對(duì)兩載體用NcoⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切連接，要得到連接產(chǎn)物pCEG會(huì)比較困難。本試驗(yàn)通過分析兩載體上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一個(gè)巧妙的連接過程（見圖3）。其先將大小為3.1 kb的載體和大小為10.7 kb的載體進(jìn)行線性連接，連接成的大片段用NcoⅠ單酶切，回收后的片段進(jìn)行自連即可獲得最終載體卡盒pCEG，使得小片段和大載體連接困難的問題得到很好的解決。

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