陳紅敏 李 競 高 凌 洪 練

高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞對JAK2／STAT1信號蛋白活化的影響

陳紅敏 李 競 高 凌 洪 練

本文2011—02—14收到，2011—03—02修回，2011—03—04接受

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病常見微血管病變，已成為導(dǎo)致慢性腎衰的主要原因，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。近年來有研究提示，Janus激酶／信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus Activated Kinase-Signal Transducer and Activator of Trancriptions，JAK／STAT）信號通路與系膜細(xì)胞的增殖、肥大及細(xì)胞外基質(zhì)（Extra-cellular Matrix，ECM）分泌有關(guān)，但具體機(jī)制尚未十分清楚。本研究通過觀察高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）對JAK2、STATl的激活，以及對轉(zhuǎn)化生 長 因 子 β1（Transforming Growth Factorβ1，TGF-β1）和纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）mRNA表達(dá)和蛋白分泌的影響，探討高糖如何通過HMCs的JAK2／STAT 1信號途徑促進(jìn)TGF-β1和FN的合成，從而加速腎臟纖維化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人p-JAK2和p-STAT1單克隆抗體（購于美國 Cell Signaling Technology公司）、β-actin兔抗人多克隆抗體由美國Santa Cruz提供；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗，NC膜、RIPA裂解液、PMSF、凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、封閉液、一抗和二抗稀釋液、ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒均購于碧云天公司；TGF-β1、FN、GAPDH 引物由上海生工合成。TGF-β1、FN ELISA試劑盒購于博士德公司。

1.2 HMCs培養(yǎng)和分組

HMCs購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，保存于液氮中。復(fù)蘇HMCs，于15%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時，更換為無血清DMEM 低糖培養(yǎng)基（5.6mmol／L）使細(xì)胞同步化24 h，設(shè)為低糖對照組。然后換用30mmol／L的葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞，分別于6h、12h、24h、48h（分別為高糖培養(yǎng)6h組、12h組、24h組和48h組）提取蛋白、RNA和收集上清液，保存于—70℃。每次檢測重復(fù)3次。

1.3 RT-PCR檢測 TGF—β1、FN mRNA表達(dá)

用RNA提取試劑（Trizo1）提取 HMCs總RNA，用紫外可見分光光度儀測定其純度和含量；于反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）催化下合成c DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；TGF-β1上下游引物分別為：5’-GGT GGA AAC CCA CAAC GAA-3’和 3’-CTA AGG CGA AAG CCC TCA AT-5’，擴(kuò)增片段為321 bp；FN上下游引物分別為：5’-TAG CCC TGT CCA GGA GTT CA-3’和 3’-CTG CAA GCC TTC AAT AGT CA-5’，擴(kuò)增片段為346 bp；三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上下游引物分別為：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’和3’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-5’，擴(kuò)增片段為452 bp。TGF-β1擴(kuò)增條件為：94℃30 s，58℃30 s，72℃50 s，循環(huán)35次；FN 擴(kuò)增條件為：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃50 s循環(huán)40次。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下凝膠成像系統(tǒng)成像，用UVI圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，以目的基因片段／GAP-DH片段的條帶灰度值比值來表示其相對含量。

1.4 ELISA 檢測上清液中 TGF—βl、FN 蛋白含量

取HMCs培養(yǎng)的上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行TGF—βl、FN濃度測定。

1.5 Western blotting檢測p-JAK2、p-STAT1蛋白的表達(dá)

（1）RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，取上清；（2）BCA法測定上清蛋白濃度；（3）取細(xì)胞裂解蛋白50 μɡ，經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜），封閉液封膜2h，加兔抗人 p-JAK2、p-STAT1抗體（1∶800稀釋），4℃過夜，TBST洗膜后加 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶5000稀釋）孵育1h、TBST洗膜后加ECL試劑，將NC膜壓片、顯影、定影。用美國UVP公司abworks 4.5分析系統(tǒng)軟件對電泳條帶進(jìn)行定量分析，測定雜交條帶的吸光度（A）值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響（圖1、表1）

與低糖對照組比較，高糖各組TGF-β1 mRNA表達(dá)上調(diào)，除6h外，12h、24h、48h差異均有顯著性意義（P＜0.01）；并隨作用時間延長，其表達(dá)逐漸增加。

注：與低糖對照組比較，△P＜0.01圖1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF-β1 mRNA的影響

2.2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對FN mRNA表達(dá)的影響（表1、圖2）

與低糖對照組比較，高糖各組FN m RNA表達(dá)上調(diào)，除6h和12h外，24h和48 h與其差異均有顯著性意義（P＜0.01）。

表1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF—β1、FN mRNA的影響（灰度比值，±s，n＝3）

表1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF—β1、FN mRNA的影響（灰度比值，±s，n＝3）

注：與低糖對照組比較，1）P＜0.01

組 別 T G F-β 1 0.3 7±0.0 1 0.4 0±0.0 6培養(yǎng)6 h組 0.4 0±0.0 4 0.4 9±0.0 4培養(yǎng)1 2 h組 0.5 3±0.0 2 1） 0.5 1±0.0 3培養(yǎng)2 4 h組 0.6 4±0.0 2 1） 0.7 6±0.1 2 1）培養(yǎng)4 8 h組 0.6 7±0.0 1 1） 0.8 2±0.1 5 1）低糖對照組F N

圖2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對FN mRNA的影響

2.3 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對上清液中TGF-β1、FN蛋白含量的影響（表2）

與低糖對照組比較，高糖各組上清液中TGF-β1、FN含量增高，除6h和12h外，其余各組差異均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），隨時間延長，其表達(dá)逐漸增加，48h達(dá)到高峰。其中，TGF-β1在24h和48h之間無顯著性差異，而FN在24h和48h之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF—β1、FN蛋白含量的影響（±s，n＝3）

表2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對TGF—β1、FN蛋白含量的影響（±s，n＝3）

組 別 TGF-β1（pg／ml） FN（ng／ml）274.48±10.28 44.13±2.29培養(yǎng)6h組 284.07±13.06 47.98±4.81培養(yǎng)12h組 294.65±13.11 58.31±6.40培養(yǎng)24h組 316.07±27.201） 95.57±10.911）培養(yǎng)48h組 324.40±16.691） 166.74±16.351）2）低糖對照組

注：與低糖對照組比較，1）P＜0.01；與培養(yǎng)24h組相比，2）P＜0.01

2.4 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對p-JAK2蛋白表達(dá)的影響（圖3）

與低糖對照組比較，高糖各組p-JAK2表達(dá)增高，24h時達(dá)到高峰，48h有所回落。

圖3 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對p-JAK2蛋白的影響

2.5 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對p-STAT1蛋白表達(dá)的影響（圖4）

與低糖對照組比較，高糖各組p-STAT1表達(dá)增高，并隨著時間延長，其表達(dá)水平逐漸增加，48h達(dá)到高峰。

圖4 高糖培養(yǎng)HMCs不同時間對p-STAT1蛋白的影響

3 討 論

DN是糖尿病常見微血管病變，是導(dǎo)致慢性腎衰的主要病因之一。DN的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，ECM的累積和腎臟纖維化是其主要病理改變［1］，而 細(xì) 胞 因 子 TGF-β1、結(jié) 締 組 織 生 長 因 子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）等在ECM累積和腎臟纖維化過程中發(fā)揮著不可忽視的作用［2］。

TGF-β1是調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞ECM積聚的重要細(xì)胞因子。一方面，TGF-β1可以刺激ECM蛋白成分（FN、膠原蛋白）的產(chǎn)生；另一方面，它能抑制蛋白酶的分泌，減少ECM蛋白的降解。在糖尿病患者和動物模型中，腎小球中TGF—β1 mRNA水平和基質(zhì)成分較正常者顯著增高，如腎小球基底膜增厚和系膜外基質(zhì)的擴(kuò)增［3］，高糖體外培養(yǎng) HMCs，TGF-β1和FN表達(dá)顯著增加［4］等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與低糖對照組比較，高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，TGF-β1、FN mRNA和蛋白水平顯著增高，在培養(yǎng)48h左右達(dá)到高峰。高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞TGF-β1和FN的合成增多，可能與高糖活化蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）的一個或多個亞型有關(guān)［5］。

JAK／STAT途徑是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并活化相應(yīng)靶基因，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)JAK／STAT信號通路的激活可以刺激腎小球系膜細(xì)胞過度增殖和增生，導(dǎo)致DN［6］。在 DN 患者腎小球和腎小管中，JAK／STAT通路顯著上調(diào)，其中JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT3的表達(dá)較正?；颊呙黠@增高［7］。在NRK-49F細(xì)胞中，糖基化終末產(chǎn)物可以促進(jìn)JAK2的磷酸化，進(jìn)而激活STAT1、STAT3；加入JAK2特異抑制劑AG-490，STAT1和STAT3的活性減低，膠原蛋白的合成減少，從而減少ECM累積［8］。Wang等［9］研究表明：高糖可激活腎小球系膜細(xì)胞JAK2、STAT1、STAT3、STAT5活性，但其可能是通過激活JAK2／STAT1信號蛋白刺激TGF-β1和FN合成，導(dǎo)致ECM的累積和腎臟纖維化，而非JAK2／STAT3、STAT5信號通路。本實(shí)驗(yàn)觀察JAK2／STAT1信號蛋白途徑在ECM聚集的作用，結(jié)果表明：高糖培養(yǎng)時，HMCs的JAK2、STAT1磷酸化蛋白水平較低糖對照組顯著增加，并分別在高糖作用24h和48h達(dá)到較高水平。對JAK2的這種活化效果，有研究認(rèn)為其可能與高糖促進(jìn)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生有關(guān)［10，11］。

JAK2／STAT1通路影響 TGF-β1合成的機(jī)制尚不十分清楚。有文獻(xiàn)提示，JAK2／STAT1信號通路活化后可能通過促進(jìn)核因子（c-jun、c-fos）基因的表達(dá)來增加TGF-β1和FN的合成［6］。jun、fos基因分別編碼的Jun和Fos蛋白嵌合成二聚體復(fù)合物活化蛋白1（Activator Protein-1，AP-1），而 TGF-β受體的基因啟動子含有AP-1的結(jié)合位點(diǎn)［12］。由此推測，HMCs經(jīng)高糖促進(jìn)ROS的合成而激活JAK2／STAT1通路，進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子（如AP-1）活化、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄等一系列變化，最終引起ECM的大量聚集，加速腎臟纖維化。

綜上，高糖作用下 HMCs中 TGF-β1、FN mR-NA和蛋白水平的升高與JAK2／STAT1磷酸化密切相關(guān)。更進(jìn)一步說明JAK／STAT信號途徑可能在DN發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而為DN的預(yù)防和治療提供又一個靶點(diǎn)。

本文第一作者簡介：

陳紅敏（1985～），女，漢族，碩士研究生，研究方向：糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制

1 Raptis AE，Viberti G.Pathogenesis of diabetic nephropathy.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109（2）：S424～S437.

2 Flyvbjerg A.Putative pathophysiological role of growth factors and cytokines in experimental diabetic kidney disease.Diabetolo-gia，2000，43（10）：1 205～1 223.

3 Chen S，Jim B，Ziyadeh FN.Diabetic nephropathy and transfor-ming growth factor-beta：transforming our view of glomerulo-sclerosis and fibrosis build-up.Semin Nephrol，2003，23（6）：532～543.

4 Lin CL，Wang JY，Ko JY，et al.Dickkopf-1 promotes hypergly—cemia-induced accumulation of mesangial matrix and renal dys-function.J Am Soc Nephrol，2010，21（1）：124～135.

5 Kapor-Drezgic J，Zhou X，Babazono T，et al.Effects of high glu-cose on mesangial cell protein kinase C-delta and-epsilon is polyol pathway-dependent.J Am Soc Nephrol，1999，10（6）：1 193～1 203.

6 Marrero MB，Banes Berceli AK，Stem DM，et al.Role of the JAK／STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.Am J Fhysiol Renal Physiol，2006，290（4）：F762～F768.

7 Berthier CC，Zhang H，Schin M，et al.Enhanced expression of Ja-nus kinase-signal transducer and activator of transcription path-way members in human diabetic nephropathy.Diabetes，2009，58（2）：469～477.

8 Huang JS，Guh JY，Chen HC，et al.Role of receptor for advance glycation end-products（RAGE）and the JAK／STAT-signaling pathway in AGE-induced collagen production in NRK-49F cells.J Cell Biochem，2001，81（1）：102～113.

9 Wang X，Shaw S，Amiri F，et al.Inhibition of the JAK／STAT signaling pathway prevents the high glucose-induced increase in tgf-beta and fibronectin synthesis in mesangial cells.Diabetes，2002，51（12）：3 505～3 509.

10 Ha H，Lee HB.Reactive oxygen species as glucose signaling mole-cules in mesangial cells cultured under high glucose.Kidney Int，2000，58（77）：S19～S25.

11 Schieffer B，Luchtefeld M，Braun S，et al.Role of NAD（P）H oxidase in angiotensin II-induced JAK／STAT signaling and cy—tokine induction.Circ Res，2000，87（12）：1 195～1 201.

12 Chuang LY，Guh JY，liu SF，et al.Regulation of typeⅡtransfor-ming growth factor-bete receptors by protein kinase C iota.Bio-chem J，2003，375（2）：385～393.

高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞對JAK2／STAT1信號蛋白活化的影響

陳紅敏，李 競，高 凌，等／武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢430060

目的：觀察高糖對人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）Janus酪氨酸激酶2（JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1（STAT1）以及轉(zhuǎn)化生長因子—β1（TGF-β1）和纖維連接蛋白（FN）表達(dá)的影響。方法：將HMCs于高糖（30mmol／L）環(huán)境下培養(yǎng)不同時間后，Western blotting檢測磷酸化JAK2、STAT1（p-JAK2、p-STAT1）水平；RT-PCR 檢測TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)；ELISA測定上清液中 TGF-β1和FN的含量，同時以低糖組作為對照。結(jié)果：與低糖對照組比較，高糖培養(yǎng) H MCs p-JAK2、p—STAT1蛋白明顯上調(diào)，TGF-β1和FN mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論：高糖能通過激活HMCs中JAK2／STAT1信號途徑，促進(jìn)TGF—β1和細(xì)胞外基質(zhì)分泌。

糖尿病腎病 細(xì)胞外基質(zhì) Janus酪氨酸激酶／信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子

人腎小球系膜細(xì)胞 高糖

Effect of High Concentration of Glucose on the Activation of Janus Kinase 2／Signal Transducers and Activators of Transcription 1（JAK2／STAT1）in Human Glomerular Me-sangial Cells

Chen Hongmin，Li Jing，Gao Ling，et al／Department of Endocrinology，Renmin Hospital of Wu-han Universty，Wuhan 430060

Objective：To investigate the effect of high concentration of glucose on the activation of janus kinase 2（JAK2）signal transducers and activa-tors of transcription 1（STAT1）and on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin （FN）in human glomerular mesangial cells（H MCs）.Method：HMCs were treated with high glucose（30mmol／L glucose）for different time respectively.Tyrosine phosphoryl-ation of JAK2（p-JAK2）and STAT1（p-ATAT1）protein were detected by Western blotting.TGF-β1and FN mRNA was assessed by semi-quantita-tive reverse transcription and polymerase chain reaction（RT-PCR）.The protein synthesis of TGF-β1 and FN in the supernatants were determined by enzyme-linked immunoadsorbent assay（ELISA）low glucose as control group.Results：Compared with control group，the expression of p-JAK2，p-STAT1，TGF-β1mRNA，F(xiàn)N mRNA and the protein level of TGF-β1，F(xiàn)N were significantly incresed in HMCs under high concentration of glu-cose.Conclusion：Under high concentration of glucose，the overproduction of TGF-β1and FN in HMCs partly be attributable to the phosphorylation of JAK2／STAT1.

Diabetic nephropathy；Extracellular matrix；Janus ki-nase／signal transducers and activators of transcrip—tion；Human glomerular mesangial cell；High glucose

R587.2

A

1005—1740（2011）02—0023—04

武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，郵政編碼 武漢430060； 通訊作者：李 競，E-mail：lijing7823＠hotmail.com

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